本發明專利技術公開了一種采用光激發化學發光免疫分析對血清中的靶物質進行定性與定量檢測的方法，包括向待測標本中加入包被靶物質抗體的發光微球、生物素包被靶物質抗體、鏈親和素（SA）包被的感光微球進行第一次免疫反應和檢測的步驟，還包括向反應體系中加入抗He試劑發生靶物質免疫疊加反應，并進行第二次光激發化學發光免疫檢測的步驟。本發明專利技術通過對兩次LiCA檢測結果的綜合分析達到全方位糾正Hooks效應的目標，分析過程包括根據其在一次LiCA與二次LiCA檢測的信號特征將被檢標本區分為陰、低陽、中陽，高陽與超高陽等五個濃度區間；根據第一次LiCA對低陽與超高陽濃度區段的標本進行定量分析。本發明專利技術具有結果準確，操作簡便，適用范圍廣等特點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物學領域中的標記免疫分析方法，具體涉及一種采用光激發化學發光(Light initiatd Chemiluminescence Assay, LiCA)免疫分析對血清中的祀物質進行定性與定量檢測的方法。
技術介紹
均相免疫指全部的反應與結果的觀察均在均一的液相界面進行的免疫學檢測方法，操作簡潔是均相免疫的主要特征。光激發化學發光(LiCA)免疫分析是這類方法的主要代表，亦是目前已經商品化的主要均相免疫技術之一，與酶聯免疫分析(ELISA)、電化學發光免疫分析等固相免疫分析相比，LiCA免疫分析涉及時間分辨熒光，納米微球研究，受體(生物素與親和素)固定，特殊的能量轉遞方式及均相免疫反應等多種前沿科學成果，其技·術含量最高，實驗操作最簡潔，但因Hooks效應的影響妨礙了其市場推廣。Hooks效應即鉤狀效應，其表現為當反應體系中待測物質(包括抗原或抗體)的濃度升高到一定程度后，檢測信號反而下降或顯著下降，甚至出現假陰性結果，由此造成的后果首先是個別靶物質含量極高的強陽性標本表現出假陰性，其次為陽性標本中大約10 30%左右強陽性標本，被誤判為弱陽或低濃度陽性。這種存在于多種血清學檢測中的量(待測物濃度)效(檢測信號)分離現象的產生雖可能與待測免疫分子的結構相關，但反應體系中靶物質與對應免疫物質比例的高度失調是其最主要的原因。這一效應如果發生于某些特殊臨床檢測如血清HBsAg的篩選，則可造成大量臨床標本的定量檢測結果偏離真值，部分強陽性標本測值降低或顯著降低，甚至導致個別具有高度傳染性的強陽性標本出現假陰性結果。如果這種漏檢發生在獻血員篩選，則勢必導致受血者發生輸血相關性肝炎的嚴重臨床事件。鑒于血清HBsAg檢測的范圍及其社會影響面極大，我國已明令禁止“一步法”檢測在獻血員HBV感染者篩選中的應用。通過近十余年的努力，對Hooks效應干擾的認識已有很大提高，針對固相免疫實驗中的Hooks效應糾正方法不斷出現。但由于反應方式的大相徑庭，這些方法都不能用于均相免疫實驗，而有效拮抗均相免疫中Hooks效應影響的方法迄今尚未見報道與公布。均相與固相免疫的主要差別，還在于全部的固相免疫試驗在操作上均存在一次甚至多次已反應物與未反應物質的分離，而均相免疫在整個的實驗過程中，尤其是實驗信號的米集完成后，試劑體系中的未反應物單獨或與反應后物質一道存在于同一反應孔(管)中，并很好地保留著與隨后加入靶物質結合的能力，這一差別，為“靶物質疊加反應”在均相免疫實驗中的實施提供了契機。此外，免疫學檢測方法的定量檢測范圍通常均較為局限，敏感性越高的試驗方法其定量范圍通常越窄，發光分析雖然在一定程度上能糾正這一現象，然而在兼顧方法敏感性，特異性，穩定性及試劑成本的前提下，其定量檢測范圍亦僅在1000ng/ml左右。如何采用單一檢測對多數靶物質實施全程或亞全程定量分析已經成為制約免疫學技術發展的重要技術瓶頸。血清學免疫檢測技術至少包括固相與均相免疫兩類，能接受本專利措施的血清免疫學檢測實驗方法須具備以下前提。①不發生試劑系統對靶物質的結合能力的自消耗不發生已反應物與未反應物間的相互分離與清除“未參與反應的試劑”能在系統中較長時期保留與靶物質反應并生成檢測信號的能力。符合上述條件的實驗方法多集中在均相免疫實驗，光激發化學發光免疫分析(LiCA)是其中的重要代表。現有血清免疫學試驗盡管存在上述缺點，但在技術發展上均達到或基本達到在當前物質與技術條件下該技術可具備的最佳的狀態。包括合理的實驗步驟與反應條件，完善的試驗操作與檢測系統(儀器)，穩定的試劑質量，以及良好地檢測品質(高度的特異性敏感性與穩定性)等。部分還預留進一步完善與發展的技術方向。本專利專利技術以上述各實驗方法的最新技術成果為基礎，全盤接受上述試驗技術發展所取得的優良技術特征，不排斥正在或將要進行的適合本專利技術實施的任何技術革新與改造，為適應本專利實施所進行的相關改造(包括試劑改造與實驗儀器改造)亦以不妨礙原有試驗的操作以及技術特征的充分發揮為前提。
技術實現思路
本專利技術的目的是對現有的光激發化學發光免疫分析方法進行改進，提供一種能糾正Hooks效應并擴大定量檢測范圍的光激發化學發光免疫分析方法。上述目的是通過以下技術方案實現的一種采用光激發化學發光免疫分析對血清中的待測靶物質進行定性或定量檢測的方法，包括如下步驟向血清中依次加入包被靶物質抗體的發光微球、生物素標記的靶物質抗體、鏈親和素包被的感光微球，混勻后溫育以發生免疫反應；然后用激發光激發上述免疫反應后的反應體系，并第一次檢測反應體系所發出的發射光的光子信號強度，檢測出的光子信號強度依據靶物質濃度與發光信號強度的標準曲線關系，第一次確定靶物質含量；在第一次檢測反應體系所發出的發射光的光子信號強度后，向免疫反應后的反應體系中加入抗He試劑，混勻后溫育發生免疫疊加反應；然后用激發光激發上述免疫疊加反應后的反應體系，并第二次檢測反應體系所發出的發射光的光子信號強度；根據第一次和第二次的光子信號強度推導新的靶物質含量與信號強度的關系，并據此計算待測標本中的靶物質濃度所述的反應體系與抗He試劑的體積比為5-50:1，當所述待測靶物質為抗原時，所述的抗He試劑中靶物質的濃度為10_200000ng/ml ；當所述待測靶物質為抗體時，所述的抗He試劑中靶物質的濃度為I. 0-20000IU/ml ο當所述待測靶物質為抗原(如血清HBsAg)時，優選的抗He試劑中靶物質的濃度為2000ng/ml。當所述待測靶物質為抗體(如血清抗HBc)時，優選的抗He試劑中靶物質的濃度為1000IU/ml。優選的，所述的反應體系與抗He試劑的體積比為10:1。優選的，所述激發光波長為680nm,發射光波長為610_615nm。所述包被靶物質抗體的發光微球的濃度為lO-lOOPg/ml，所述生物素標記的靶物質抗體濃度為I. O-lOPg/ml，所述鏈親和素包被的感光微球濃度為lO-lOOPg/ml，所述血清與包被靶物質抗體的發光微球、生物素標記的靶物質抗體、鏈親和素包被的感光微球的體積比依次為1:1:1:7。所述室溫下溫育的時間為5-60分鐘。所述上述各項試驗條件，以能產生足以可供分析的試驗信號，并以不發生對試驗效果的干擾為前提，由于本專利主要專利技術點為抗He介入及其靶物質疊加免疫反應，現階段LiCA檢測部分的主要實驗條件(即優選實驗條件)的選擇依據市售試劑的規定，并接受可能出現的適宜本專利實施的改進；所述的方法在血清HBsAg、抗HBc、AFP定性和定量檢測中的應用。在LiCA檢測中，當第一次LiCA反應及其檢測完畢后，包括標本在內的全部的反應體系仍舊存在于反應孔中。陰性，及其低濃度陽性孔中的抗體或包被了抗體與親和素的發光微球未經或僅部分與靶物質(如抗原)發生反應，全部或多數抗體或包被了抗體的發光微球得以保留并具備與后續加入的靶物質發生反應的能力，其反應強度足以使第二次LiCA檢測所獲得的信號(單獨或與一次LiCA反應信號疊加)達到飽和或過飽和狀態。在“靶物質疊加反應”過程中能與隨后加入的靶物質(其濃度以能產生可供識別與分析的試驗信號為度，通常以產生飽和LiCA信號的靶物質的2倍為佳)發生反應并產生新的實驗信號，這一信號與第一次LiCA檢本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種采用光激發化學發光免疫分析對血清中的待測靶物質進行定性或定量檢測的方法，包括如下步驟：向血清中依次加入包被靶物質抗體的發光微球、生物素標記的靶物質抗體、鏈親和素包被的感光微球，混勻后溫育以發生免疫反應；然后用激發光激發上述免疫反應后的反應體系，并第一次檢測反應體系所發出的發射光的光子信號強度，檢測出的光子信號強度依據靶物質濃度與發光信號強度的標準曲線關系，第一次確定靶物質含量；其特征在于：在第一次檢測反應體系所發出的發射光的光子信號強度后，向免疫反應后的反應體系中加入抗He試劑，混勻后溫育發生免疫疊加反應；然后用激發光激發上述免疫疊加反應后的反應體系，并第二次檢測反應體系所發出的發射光的光子信號強度；根據第一次和第二次的光子信號強度推導新的靶物質含量與信號強度的關系，并據此計算待測標本中的靶物質濃度：所述的反應體系與抗He試劑的體積比為5?50:1；所述待測靶物質為抗原時，所述的抗He試劑中靶物質的濃度為10?200000ng/ml；所述待測靶物質為抗體時，所述的抗He試劑中靶物質的濃度為1?20000IU/ml。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李方和，李時君，
申請(專利權)人：李方和，
類型：發明
國別省市：
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