本發明專利技術公開了一種GA4和/或GA7的分離純化方法,屬于生物分離領域。主要包括萃取、反萃取、減壓濃縮、結晶分離、溶點檢測及高效液相色譜檢測。解決了目前赤霉素GA4和/或GA7分離純化困難、高效檢測技術空缺、設備要求高、工藝復雜等問題。本發明專利技術根據GA4和/或GA7與其它GA在不同有機相與水相的分配系數的不同，建立了萃取體系，經減壓濃縮和結晶分離后用快速的溶點檢測粗略判斷純度再結合高效液相色譜定量檢測。簡化了分離過程、提高了檢測精度、節約了成本、工藝簡單、易操作、適合工業化生產。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種GA4和/或GA7的分離純化方法，具體涉及萃取、反萃取、減壓濃縮、結晶分離，屬于生物分離領域。
技術介紹
赤霉素(Gibbeerllins,簡稱GAs)是一種天然的植物生長調節劑,對植物生長具有多種生理功能，可以調節植物生根、發芽、生長以及開花結果等過程，因此在農作物生產及蔬菜種植中有著廣泛應用。現已發現的赤霉素達百余種，但它還不能完全由化學法合成，目前工業化生產的赤霉素均是由微生物發酵獲得。GA3是菌種發酵積累的主要產物，也是所有赤霉素中生理活性最強，應用最廣泛的。至今GA3的發酵、分離檢測技術已經發展得相當成熟。隨著研究的深入，逐步發現GA3應用上的局限性。例如6^在使胚軸生長的 過程中會降低植物的抗倒伏性，在提高果樹座果率的同時會引起過度生長，影響果實的形狀等。新型赤霉素產品的開發成為當前研究的熱點，GA4+7以其較高的活性和獨特的優勢成為目前最有潛力的品種。GA4+7的研究還處于起步階段，GA4+7的生產能力仍處于較低水平，其價格是GA3的幾十倍。對菌種進行誘變或利用基因工程手段進行改良后的菌種生產效價有所提高，但仍不能得到單一的GA4+7，發酵液中存在各種赤霉素混合物，給后期的分離純化帶來了困難。GA4與GA7均是19碳赤霉素，其化學結構上僅有一個雙鍵之差，化學性質非常相近，所以一般的檢測方法也很難將其區分開。當前建立一種有效的GA4和/或GA7的分離純化和檢測方法將具有很好的應用前景。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種GA4和/或GA7分離純化方法，該分離方法能得到純度較高的GA4和/或GA7,經由HPLC定量測試后發現其純度高于96%。本專利技術的技術方案為一種GA4和/或GA7的分離純化方法，其具體步驟如下(I)將含GA4和/或GA7的溶液用酸調pH4. O 7. 0，加入有機溶劑振蕩萃取，得萃取液；將萃取液轉移到分液漏斗，靜置待分層后，分別得到有機相A與溶液；(2)將步驟(I)中分層得到的溶液用酸調PH2. O 3. 0，再加入有機溶劑振蕩萃取，得萃取液；將萃取液轉移到分液漏斗，靜置待分層后，得有機相B;(3)將步驟(I)和(2)所得的有機相A與有機相B混合，得有機相混合液，加入用酸調pH4. O 6. O的蒸餾水振蕩萃取，得萃取液；將萃取液轉移到分液漏斗，靜置待分層后，得有機相C;(4)向有機相C中加入吸附劑吸附，過濾后得濾液；( 5 )將步驟(4 )得到的濾液減壓濃縮，待液體全部旋干后，收集固體物質；(6)將收集的固體物質溶解到有機混合物中，低溫下重結晶；過濾收集晶體。 優選步驟(I)中所述的含GA4和/或GA7溶液為含有GA4和/或GA7的赤霉菌發酵液或者是含有GA4和/或GA7的赤霉素混合物溶液；其中赤霉菌發酵液或者是赤霉素混合物溶液中GA4和/或GA7的質量百分含量為5% 90% ;步驟(I)和(2)中加入的有機溶劑均為Cl-ClO的醇、Cl-ClO的酯或Cl-ClO的酮；步驟(I)和(2)中萃取時有機溶劑與步驟(I)中的含GA4和/或GA7溶液的體積比均為I : (3 5);步驟(3)中有機相混合液與蒸餾水體積比為I: (3 5)。更優選步驟(I)和(2)中加入的有機溶劑均為乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基乙基酮、戊酮、正丁醇或正戊醇。優選步驟(I)、(2)和(3)中調pH的酸均為HCl或H2SO4 ;步驟(I )、(2)和(3)中振蕩萃取的條件均為搖床轉速120 160rpm,萃取時間O. 5 I. 5小時。優選步驟(4)中加入的吸附劑為活性碳、皂土或硅酸鹽；吸附劑的加入質量與有機相C體積的比為I 3g/100ml ;吸附時間為O. 5 lh。優選步驟(5)中減壓濃縮過程轉速為50 90rpm，溫度為25 35°C，真空度為 O.07 O. IMPa0 優選步驟(6)中的有機混合物為乙酸乙酯與乙醚混合物，其中乙酸乙酯與乙醚的體積比為I: (2 5);所述的低溫為-20 -30°C。本專利技術中HPLC檢測條件為RPC18，250X4mm柱，流動相為60%乙腈和1%丙酮及5mmol/L NH4H2PO4, pH2. 5，柱溫 25°C，流速 I. Oml/min,紫外波長 205nm 進行檢測。有益效果(I)利用溶劑萃取、反萃取、減壓濃縮及結晶技術分離純化GA4和/或GA7,該工藝簡單，設備要求低，處理量大，適合于大規模放大生產。通過萃取與反萃取技術，有效提高了GA4和/或GA7提取率及純度。(2)該工藝過程能特異的分離到GA4、GA7或GA4+7，若混合物中僅含GA4或GA7,則可以得到GA4、GA7，若含GA4與GA7的混合物則可得到GA4+7。(3)提取到的產品用HPLC及溶點輔助純度檢測方法。先檢測提取物溶點，進行粗略純度的判斷，再進行HPLC檢測，提高了效率，節約了檢測成本。具體實施例方式以下結合實例來進一步解釋本專利技術，但實施案例并不對本專利技術做任何形式的限定。實施案例I量取600ml赤霉菌發酵液，經檢測后GA4+7的質量占赤霉菌發酵液質量的5%，用HCl調pH4. O，加入200ml乙酸乙酯，120rpm下振蕩萃取O. 5h，得萃取液。將萃取液轉移到分液漏斗，靜置待分層后，分別得到機相A與溶液。將溶液用HCl調pH2. O，再加入200ml乙酸乙酯，120rpm下振蕩萃取0.5h，得萃取液，將萃取液轉移到分液漏斗，靜置待分層后，得有機相B。將所得的有機相A與B混合，得有機相混合液400ml，加入用HCl調pH4. O的蒸餾水1200ml，120rpm下振蕩萃取O. 5h,得萃取液，將萃取液轉移到分液漏斗，靜置待分層后，得有機相C400ml;向有機相C中加入4g活性碳，吸附O. 5h后過濾收集濾液。將濾液在50rpm，溫度為25°C，真空度為O. 095MPa下減壓濃縮直到液體全部旋干，收集固體物質。將固體物質溶解于體積比I :5的乙酸乙酯與乙醚混合物中，放于_20°C結晶，過濾收集晶體。測定晶體的溶點為206. 9-209. 2°C，晶體溶解后用RPC18，250 X 4mm柱，流動相為60%乙腈和1%丙酮及5mmoI/LNH4H2PO4, pH2. 5，柱溫25 V，流速I. Oml/min,紫外波長205nm進行檢測，GA4 為 27%, GA7 為 69%,雜質為 4%。實施案例2量取600ml赤霉素混合溶液，經檢測后GA4的質量占赤霉素混合溶液質量的70%，用H2SO4調pH5. 5，加入150ml戊酮，140rpm下振蕩萃取lh，得萃取液。將萃取液轉移到分液漏斗，靜置待分層后，分別得到機相A與溶液。將溶液用H2SO4調pH2. 5，再加入150ml戊酮，140rpm下振蕩萃取lh，得萃取液，將萃取液轉移到分液漏斗，靜置待分層后，得有機相B。將所得的有機相A與B混合，得有機相混合液300ml，加入用H2SO4調pH5. O的蒸餾水1200ml, 140rpm下振蕩萃取Ih,得萃取液，將萃取液轉移到分液漏斗，靜置待分層后，得有機相C300ml;向有機相C中加入6g阜土,吸附45min后過濾收集濾液。將濾液在70rpm,溫度為30°C，真空度為O. 085MPa下減壓濃縮直到液體全部旋干，收集固體物質。將固體物質溶解于體積比I :3的乙酸乙酯本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種GA4和/或GA7的分離純化方法，其具體步驟如下：（1）將含GA4和/或GA7的溶液用酸調pH4.0～7.0，加入有機溶劑振蕩萃取，得萃取液;將萃取液轉移到分液漏斗，靜置待分層后,分別得到有機相A與溶液;（2）將步驟（1）中分層得到的溶液用酸調pH2.0～3.0,再加入有機溶劑振蕩萃取,得萃取液;將萃取液轉移到分液漏斗，靜置待分層后,得有機相B;（3）將步驟（1）和(2)所得的有機相A與有機相B混合，得有機相混合液，加入用酸調pH4.0～6.0的蒸餾水振蕩萃取,得萃取液;將萃取液轉移到分液漏斗,靜置待分層后,得有機相C;（4）向有機相C中加入吸附劑吸附，過濾后得濾液;（5）將步驟（4）得到的濾液減壓濃縮，待液體全部旋干后，收集固體物質;（6）將收集的固體物質溶解到有機混合物中，低溫下重結晶;過濾收集晶體。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊文革，胡永紅，李佼佼，唐容容，
申請(專利權)人：南京工業大學，
類型：發明
國別省市：
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