一種生物活性骨組織工程材料的制備方法，制備步驟為：移取非晶形納米羥基磷灰石溶液，超聲波分散，將絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白溶解在羥基磷灰石溶液中，混勻；0～4℃預冷1～5h，混勻；-20～-70℃預凍6h～24h，-40～-80℃冷凍干燥，獲得生物活性骨組織工程材料。本發明專利技術制備生物活性軟骨組織修復多孔復合支架，通過磺酸化絲素蛋白的引入，獲得具有可降解和高度生物活性，能夠激活預修復組織細胞的基因表達，提高細胞的增殖和分化；主動誘導、激發組織器官再生，實現人體缺損組織器官的再生和重現的生物材料，引入生物活性骨修復材料的概念。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物材料領域，涉及骨組織修復材料，特別涉及一種生物活性骨組織工程材料及其制備方法。
技術介紹
自20世紀80年代Robert Langer和Joseph P Vacanti首次提出“組織工程學”概念后，為眾多的組織缺損、器官功能衰竭病人帶來希望，引起了國內外學者廣泛關注。骨組織工程材料的發展，從機體對材料的反應性來看，經歷了 20世紀60 70年代的生物惰性材料、上個世紀末的生物反應性材料、以及促進組織再生性的生物活性材料三個階段。對于骨組織工程材料的研究，目前主要集中在生物反應性材料以及其制備方法學的研究，而對于促進組織再生的生物活性材料的研究較少。生物活性材料是指具有可降解和高度生物活性，能夠激活預修復組織細胞基因的表達，提高細胞的增殖和分化；主動誘導、激發組織 器官再生，實現人體缺損組織器官的再生和重現的生物材料。骨組織工程材料由無機和有機材料兩部分組成，本專利技術無機材料采用生物陶瓷類，有機材料采用修飾后的天然高分子類材料。絲素蛋白由蠶繭或蠶絲經脫膠、溶解、透析及冷凍干燥獲得，具有較好的組織相容性、可控的生物降解性、優良的機械性能、較少的免疫原性以及特定的化學組成，被廣泛應用于眼角膜、血管、人造皮膚、韌帶及骨等組織工程領域。研究發現，通過磺酸化絲素蛋白有高度的生物學活性，能夠激活預修復組織細胞的基因表達，提高細胞的增值和分化。羥基磷灰石是一種生物活性陶瓷，與人體骨的Ca/P比與其極為相似，具有良好的骨傳導性和生物活性，并且相態比較穩定，無毒副作用，而非晶態的羥基磷灰石具有一定的溶解性，可以提高材料及組織周圍鈣、磷的含量，促進骨細胞及組織生成。根據以上研究結果，本專利技術采用磺酸化絲素蛋白和非晶態的羥基磷灰石為原料，制備骨修復多孔支架材料。目前，2009年我國專利CN101502672A公開了羥基磷灰石/絲素蛋白多孔支架的制備方法，采用的是戊二醛交聯絲素蛋白和羥基磷灰石，然后凍融兩次并干燥獲得多孔支架材料，對骨組織修復材料的性能有所改善。2011年專利CN102302804A公開了羥基磷灰石基生物復合支架及組織工程骨，采用粒子浙濾結合冷凍干燥制備了生物反應性骨修復材料，制備出可降解的骨修復材料。然而，骨修復材料的研究主要集中在第二代骨修復材料中制備方法學的研究，生物活性材料的研究報道甚少。因此，以具有生物活性的磺酸化絲素蛋白為基材制備組織工程多孔支架材料，提高軟骨修復材料的生物活性，對骨組織工程材料的開發具有十分重要的意義。
技術實現思路
解解決的技術問題針對上述現有技術不足，為了提高骨組織工程材料自身的生物活性，本專利技術擬采用添加少量羥基磷灰石作為晶核，與磺酸化絲素蛋白進行混合，通過冷凍干燥方法制備多孔骨修復材料，進一步促進骨組織的再生，主動誘導、激發組織器官再生，實現人體缺損組織器官的再生和重現的生物材料。技術方案，制備步驟為移取10 100mg/mL的非晶形納米輕基磷灰石溶液，超聲波分散30min Ih,將絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白溶解在羥基磷灰石溶液中，混勻，使溶液中總蛋白的質量百分比濃度為I 20%，無機非結晶羥基磷灰石的質量百分比濃度為O. 01 5% ;0 4°C預冷I 5h，混勻；-20 -70°C預凍6h 24h，-40 -80°C冷凍干燥，獲得生物活性骨組織工程材料。所述絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白的質量比為I : (7 O. 25)。有益效果(I)本專利技術制備生物活性軟骨組織修復多孔復合支架，以無晶形的羥基磷灰石為核可以更好促進新骨細胞及組織的再生。·(2)本專利技術制備生物活性軟骨組織修復多孔復合支架過程簡單，無毒害物質殘留，易于操作，孔與孔之間連接性較好，孔隙率較高，滿足骨修復材料的要求。(3)本專利技術制備生物活性軟骨組織修復多孔復合支架，通過磺酸化絲素蛋白的引入，獲得具有可降解和高度生物活性，能夠激活預修復組織細胞的基因表達，提高細胞的增殖和分化；主動誘導、激發組織器官再生，實現人體缺損組織器官的再生和重現的生物材料，引入生物活性骨修復材料的概念。附圖說明圖I磺酸化絲素蛋白的分子結構特征；圖2多孔復合支架材料照片；圖3多孔復合支架材料SEM分析；圖4多孔復合支架材料FTIR分析。具體實施例方式以下具體實施方式不以任何形式限制本專利技術的技術方案，凡是采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術方案均落在本專利技術的保護范圍。本專利技術所述實施例中涉及孔隙率，采用排液法進行測量，孔徑及孔與孔之間的連接性通過SEM進行表征。(I)孔隙率的測定方法采用正己烷作為替代液體(正己烷的滲透力強，且在滲透過程中對支架無膨脹和收縮作用)。恒溫條件下，將三個比重瓶中裝滿正己烷，并抽真空脫氣，至無氣泡溢出，分別稱重M0，樣品剪成大致相等的三塊分別稱重為Ms，將樣品放入比重瓶內抽真空脫氣，充分浸泡并裝滿正己烷，稱重M1，迅速取出樣品，并稱剩余正己烷及比重瓶重M2,計算得孔隙率，求平均值即得到多孔支架的孔隙率。復合支架孔障率的計算公式 M _ Μ _ Μ^(%) = 1 V * 100% Ma-M2(2)表征的條件分別為FTIR測試條件為稱取樣品與KBr混合研磨，壓片得透明薄片，壓力為15 20MPa，TENS0R27型FTIR紅外光譜儀，掃描次數32次，分辨率4cm—1，掃描速度ΙΟΚΗζ，掃描范圍4000 ^OcnT1 ;SEM條件為將干燥后的多孔復合支架，用鋒利刀片切取獲得橫截面的切片，用離子濺射儀(MSP1S，Japan)將橫截面切片進行噴金處理，于15KV條件下，觀察支架的形態結構和孔徑大小。以下實施例中Ca(NO3)2、(NH4)2ΗΡ04和氨水均為分析純AR，由國藥集團化學試劑有限公司提供。絲素蛋白的提取將分揀好的蠶苗殼剪成Imm2的小塊,料液比l:50(w/v, g/ml)浸入98±2°C，O. 5wt%Na2C0jK溶液中，浸提30min，2次，蒸餾水充分洗滌、漂洗，除去絲膠蛋白后室溫干燥。獲得的絲素蛋白浸入60°C,9. 3M LiBr水溶液，溶解4h。絲素蛋白溶液利用截留分子量為3500透析袋透析2-3d,8000rpm離心除去沉淀。10wt%聚乙二醇(分子量為20000)濃縮至10%左右，4°C保存待用。磺酸化絲素蛋白的制備將68mg對氨基苯磺酸溶解在2mL水中與ImLl. 6M對甲·苯磺酸水溶液混合冰浴冷卻，向混合液中添加ImLO. SM冰浴的亞硝酸鈉水溶液，混勻，冰浴15min得到偶氮鹽反應液，儲存待用。向4mL (約10%)的絲素硼酸鹽緩溶液(O. 2M pH9. O)添加ImL的偶氮鹽反應液，反應20min，透析2 3d，冷凍干燥，獲得磺酸化絲素蛋白。納米羥基磷灰石制備過程如下0. IM等濃度的Ca (NO3) 2和(NH4) 2ΗΡ04溶液體積比5:3,采用流加方式將反應液進行混合(流加速度100ml/h),并機械攪拌300rad/min,以氨水調節pH為10 11，反應溫度為70°C。流加結束后繼續攪拌3h，將懸濁液加熱至沸騰，除去大量氨氣。將反應液在50°C恒溫靜置48h，每靜置6h倒掉上清液加水到原體積繼續靜置陳化。然后抽濾，用蒸餾水清洗4次，冷凍干燥得到納米羥基磷灰石。實施例I準確移取O. 268mL40mg/mL輕基磷灰石衆料,超聲波分散30min,加入140m本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種生物活性骨組織工程材料的制備方法，其特征在于制備步驟為：移取10～100mg/mL的非晶形納米羥基磷灰石溶液，超聲波分散30min～1h，將絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白溶解在羥基磷灰石溶液中，混勻，使溶液中總蛋白的質量百分比濃度為1～20％，無機非結晶羥基磷灰石的質量百分比濃度為0.01～5％；0～4℃預冷1～5h，混勻；?20～?70℃預凍6h~24h，?40～?80℃冷凍干燥，獲得生物活性骨組織工程材料。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：顏輝，李紹群，唐玉斌，賈俊強，吳瓊英，江明珠，
申請(專利權)人：江蘇科技大學，
類型：發明
國別省市：
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