本發明專利技術涉及生物與醫藥技術領域，具體涉及一種在臨床樣本中快速香港型α-地中海貧血的基因檢測試劑盒。本發明專利技術進一步確認了HKαα融合基因的基因序列，與α-globin序列進行比對分析，在融合基因的保守序列區域進行引物設計。本發明專利技術的技術方案為提供一種香港型α-地中海貧血的基因檢測試劑盒，包括PCR反應液，所述PCR反應液包括引物HKαα-F和HKαα-R，所述引物為針對HKαα融合基因的保守序列區域進行引物設計的引物，所述HKαα融合基因的保守序列的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO：1。本發明專利技術試劑盒可直接用于HKαα檢測的試劑盒，能特異、快速、穩定的對HKαα基因型進行診斷。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物與醫藥
，具體涉及一種在臨床樣本中快速檢測香港型 α-地中海貧血(ΗΚα a )的試劑盒。
技術介紹
a -地中海貧血(Thalassemia，以下簡稱0-地貧)，是一組因α-珠蛋白鏈合成減少或不能合成，α-鏈/非 α-鏈比例失衡為特征的遺傳溶血性血紅蛋白病。地貧是世界上最常見的人類單基因遺傳血液病之一，被世界衛生組織列入危害人類健康的6種常見病，也是中國南方各省最常見、危害最大的遺傳病。在我國南方α-地貧的高發區，90萬人的流行病學調查得出的總發病率為2. 46%，其中廣西、廣東、江西、四川和浙江各省(區)的發病率分別為 14. 95%,4. 11%,2. 60%、I. 92% 和 I. 20%。人類α-珠蛋白基因簇位于16號染色體，每條染色體各有2個珠蛋基因。大多數α-地貧是由于α-珠蛋白基因的缺失所致，少數由基因點突變造成。若僅是一條染色體上的一個Ct-基因缺失或缺陷，則α -鏈的合成部分受抑制，稱為α +地貧；若有一條染色體上的2個α-基因均缺失或缺陷，稱為Cici地貧。重型α -地貧是α 0地貧的純合子狀態，其4個α -珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全無α-鏈生成，因而含有α-鏈的Hh A、Hb A2和HbF的合成均減少。患者在胎兒期即發生大量Y鏈合成Y4(Hb Bart' S)。Hb Bart' s對氧的親合力極高,造成組織缺氧而引起胎兒水腫綜合癥。中間型和α-地貧是0°和α +地貧的雜合子狀態，是由3個α-珠蛋白基因缺失或缺陷所造成，患者僅能合成少量α-鏈，其多余的β鏈即合成Hb Η(β4)。Hb H對氧親合力較高，又是一種不穩定血紅蛋白，容易在紅細胞內變性沉淀而形成包涵體，造成紅細胞膜僵硬而使紅細胞壽命縮短。標準型α -地貧(輕型)是α +地貧純合子或α °地貧雜合子狀態，它僅有2個α -珠蛋白基因缺失或缺陷，故有相當數量的α -鏈合成，病理生理改變輕微。靜止型α-地貧是α +地貧雜合子狀態，它僅有一個α-基因缺失或缺陷， α-鏈的合成略為減少，病理生理改變非常輕微。根據α基因突變類型分類，地貧主要包括缺失型α-地貧(DNA片段缺失)、突變型α-地貧(點突變)。我國最常見的缺失類型為-a3_7、-a42、--SEA 3種。隨著α-地中海貧血機制的進一步闡明，一些新的基因缺失類型相繼被發現“列如--11·1、-^2·4、-^7、一 、一^、!!!^ α 等。目前，HKa α地貧還沒有效的根治方法，主要以預防為主。因此開展HKa α的檢測提早發現地貧異常基因的攜帶者對指導婚前及產前診斷具有重要的意義。但目前尚未有直接檢測HK a α的產品。目前對α-地貧篩查方法主要有血常規測定、紅細胞脆性檢測、血紅蛋白電泳等， 這些方法只能對患者進行初步的地貧篩查，無法對患者基因型進行確診，容易對輕型地貧漏診。隨著技術的發展，出了地貧基因診斷的方法，主要包括以下幾種=Southern雜交、多重Gap-PCR、多重連接酶依賴探針擴增技術(MLPA)、PCR-寡核苷酸探針(ASO)法、實時熒光定量PCR、斑點雜交、直接測序技術等。各種基因診斷技術特點如下I、Southern印跡雜交-限制性酶譜分析法曾是α -地貧基因診斷的主要方法， 但由于操作繁瑣，所需時間較長，一般只適合研究使用，不適于臨床的推廣應用。2、依賴探針連接擴增技術(MLPA) :MLPA是2002年發展起來的，該方法能對所有的缺失基因型檢測以及未知的基因型開展檢測，具有高效、特異，在同一反應管內檢測多達45 個不同核酸序列拷貝數變化；常用于α缺失基因的檢測，但由于檢測成本高，操作繁瑣，耗時較長，檢測流程長達16小時，且需要特殊的儀器設備，一般只用于研究使用，不便于分子篩查方法的推廣應用。3、測序技術測序技術直接對DNA序列的分析，一直被認為是臨床檢測的金標準； 目前測序技術面臨著標本的處理(核酸提取)擴增標準化認證問題，信號檢測、測序平臺特異的出錯和糾錯問題，以及生物信息學方面可能出現的問題，臨床驗證程序和標準化問題等，一直沒有有效的解決，因此還未能在臨床中推廣應用。4、反向斑點雜交(Reverse Dot Blot, RDB)法這一方法具有靈敏度高、特異性好和準確性高等優點，目前已廣泛應用于β_地貧的臨床產前診斷和基因診斷。主要原理將大量寡核苷酸作為探針固定于固相支持物上，借助堿基互補，與經PCR擴增、與生物素標記的樣本靶分子進行雜交，經化學顯色給出雜交信號，通過計算機分析獲得信息。這種方法靈敏，但耗時較長，一般用于點突變檢測。5、Gap-PCR及其改進的技術由于其易操作，此技術廣泛用于缺失地貧的分子診斷，在缺失區域兩端設計一對引物，正常情況下兩引物擴增產物很長不屬于擴增的范圍，而出現缺失區域的時候能出現特異性的擴增。1990年Lebo等應用PCR技術檢測α -地中海貧血I，Dode和Baysal等應用PCR技術檢測α -地中海貧血2。目前市場上以Gap-PCR開發的試劑盒只能檢中國最常見的3種缺型-α3_7、-α42和一SEA，而不能檢測ΗΚα α等非常見的基因型。6、實時熒光定量PCR (Taqman探針法)實時熒光定量PCR是目前臨床診斷系統最受歡迎的檢測平臺，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積，實時監測 PCR進程及連續分析擴增相關的熒光信號，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在地中海貧血檢測中，報道的均只局限于一種基因型的檢測，工作量大，由于探針需要進行熒光標記，檢測成本高。7,PCR-寡核苷酸探針(ASO)法這一技術可快速簡便地檢測已知突變的地貧基因 (^^和βτ)，具有很高的靈敏性和準確性，但一次雜交只能檢測一種突變，而且還需要同位素探針，難以推廣應用。盡管檢測地貧的方法和產品很多，但是目前尚未有直接檢測ΗΚα α的產品。現有α -地中海貧血檢測及其缺點I、目前我國臨床應用的檢測缺失型α地貧的試劑盒均是基于多重Gap-PCR原理開發的，可以在同一 PCR體系中對多種缺失地貧基因型(一SEA、-α3 7、-α4 2)的檢測，如亞能生物技術(深圳)有限公司、深圳益生堂生物科技有限公司和廣州達安基因公司各自開發的 α -地中海貧血檢測試劑盒，這些產品均只能檢測3種常見的缺失型地貧。2、潮州凱普生物化學有限公司利用PCR與反向點雜交法結合開發的α，β _地中海貧血的突變基因聯合檢測試劑盒，除檢測一SEA、-α3·7,-α4·2三種缺失型α -地貧外，增加了 2種突變基因型(aesa、aQSa )的檢測。HKa α不在其檢測的范圍內。3、現有a -地中海貧血檢測產品專利技術中，未見直接針對HKa α的檢測。4、目前HK a α地貧的檢測均是根據臨床表型，借助現有地貧檢測試劑盒結合父母基因型的遺傳分析實現的，沒有一種快速、直接的用于檢測HKa α地貧的方法。
技術實現思路
本專利技術進一步確認了 HKa α融合基因的基因序列，與a-globin序列進行比對分析，在融合基因的保守序列區域進行引物設計。進一步通過體系及反應程序的優化，最終確定優選的引物組合、體系中各組分最終的濃度以及PCR擴增的最優程序，實現HKa α特異性擴增。本專利技術的技術方案為提供一種香港型α-地中海貧血的基因檢測試本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種香港型α？地中海貧血的基因檢測試劑盒，其特征在于，包括PCR反應液，所述PCR反應液包括引物HKαα？F和HKαα？R，所述引物為針對HKαα融合基因的保守序列區域進行引物設計的引物，所述HKαα融合基因的保守序列的核苷酸序列為：SEQ？ID？NO：1。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：梁少明，李長遠，劉晶晶，任維，
申請(專利權)人：亞能生物技術深圳有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。