油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，所述方法包括下列步驟：（1）油藏樣品的采集；（2）通過高溫滅活樣品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物；（3）收集滅活后樣品中的芽孢；（4）將收集的芽孢接種于培養基，在油藏原位溫度條件下對芽孢菌進行復活培養；（5）通過分子生物學方法檢測復活的芽孢菌菌群。本發明專利技術所述的方法能有效地檢測油藏中的芽孢桿菌（Bacillus），為油藏中采用功能芽孢桿菌（Bacillus）的發現，以及油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的生態學研究提供了一種新的可行方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種油藏中芽孢桿菌的檢測方法，具體涉及依靠培養的微生物學方法與不依靠培養的分子生物學方法相結合來揭示油藏中Bacillus多樣性的方法。
技術介紹
隨著油藏中微生物的分離和檢測，研究人員發現油藏中同時存在著對原油開采有害和有益的微生物，一些微生物的代謝產物和代謝活性能被用來提高原油采收率。根據這一特點，微生物提高原油采收率(MEOR)作為三次采油的一種重要措施被提出并實施開來。微生物提高原油采收率的主體是功能微生物菌群。根據以往的研究,芽孢桿菌(.Bacillus)是微生物提高原油采收率的一類重要的微生物菌群。芽孢桿菌(feci77m)能產生物表面活性劑降低原油與水以及巖石之間的界面張力，從而提高原油的流動性達到增加原油采收率的目的；芽孢桿菌能降解長鏈烴減低原油粘度提高原油流動性來增加原油采收率；芽孢桿菌還能產生生物聚合物選擇性地堵塞油藏中的大孔道，增加注入水的波及系數從而增加原油采收率。對于微生物提高原油采收率的實驗室研究和礦場實驗研究而言，研究棲居在油藏中的微生物是發現功能微生物菌群以及設計微生物提高原油采收率礦場試驗實施方案的 關鍵步驟。傳統的依靠培養的微生物學方法已被用來分離和鑒定油藏中的微生物，但是這些方法對微生物的富集以及分離過程復雜，大部分情況下，需要配制專一性的培養基，選擇專一性的碳原，并且富集過程有時要經過幾十輪的培養。另外一個方面，采用傳統的微生物學培養方法僅能培養出自然界中很少的一部分微生物(少于l%)(Amann et al.，1995)。因此通過傳統微生物學方法僅揭示了油藏中很少的一部分微生物。目前，分子生態學技術為微生物的檢測提供了新的方法，被廣泛用來研究自然環境中的微生物生態。研究人員也將這些方法用于油藏微生物多樣性研究，油藏中檢測到大量的不同系統發育類型的微生物種群。然而，綜觀所有國內外關于油藏微生物多樣性研究的報道，出現了一個令人費解的結果，那就是利用不基于培養的分子生態學方法，油藏樣品中很少或幾乎沒有檢測到芽孢桿菌{Bacillus、。這些結果給人們一個印象就是油藏樣品中芽孢桿菌{Bacillus、很少或油藏中不存在芽孢桿菌當利用分子生態學方法研究環境樣品中微生物群落多樣性的時候，有兩個方面的原因可能造成油藏樣品中檢測不到芽孢桿菌Ofeci77m)，第一是，芽孢桿菌是一類革蘭氏陽性、能形成芽孢的微生物菌群，DNA抽提過程中芽孢的破壁率要比其它微生物小，因此芽孢桿菌在整個分析過程中很可能被忽略；第二，分子生態學方法不能檢測到環境樣品僅占比例為O. 1%-1%微生物菌群(Head et al.，1998)。芽孢桿菌是一類革蘭氏陽性、能形成芽孢、對微生物提高原油采收率有益的功能微生物菌群。利用不基于培養的微生物學方法沒有檢測到芽孢桿菌OfeCiBm)的油藏是否真的不存在芽孢桿菌？能通過怎樣的方法來快速檢測油藏樣品中的少量芽孢桿菌菌群是目前研究人員所面臨的難題。
技術實現思路
本專利技術需要解決的技術問題就在于克服現有技術的缺陷，提供一種油藏中芽孢桿M(Mcillus)的快速檢測方法，它將傳統的微生物學和分子生物學的優點相結合，提成了一種快速檢測油藏中的芽孢桿菌方法。本專利技術所述的方法能有效地檢測油藏中的芽孢桿菌Ofeci77M)，為油藏中采用功能芽孢桿菌的發現，以及油藏中芽孢桿菌(Mcillus )的生態學研究提供了新的可行方法。為解決上述問題，本專利技術采用如下技術方案 本專利技術提供了一種油藏中芽孢桿菌的快速檢測方法，所述方法包括下列步驟 (1)油藏樣品的采集； (2)通過高溫滅活樣品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物； (3)收集滅活后樣品中的牙抱； (4)將收集的芽孢接種于培養基、在油藏原位溫度條件下對芽孢菌進行復活培養； (5)通過分子生物學方法檢測復活的芽孢菌菌群。本專利技術所述油藏為不同地質條件、不同開采方法的各類油藏。本專利技術的油減樣品包括注水井井口樣品，油井井口樣品，地層水樣品，油井返排樣品以及巖芯樣品。油藏樣品的采集步驟為將采集的油藏樣品裝入已滅菌的樣品瓶中，裝滿樣品瓶，密封，記錄樣品采集的油藏原位溫度。通過高溫滅活樣品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物步驟為，在無菌條件下取500ml的油藏樣品到無菌燒瓶中，燒瓶口覆蓋上有透氣孔的無菌微生物培養膜；將燒瓶加熱，保持沸騰10分鐘，室溫冷卻。收集滅活后樣品中的芽孢步驟具體操作為待燒瓶中樣品冷卻后，在無菌條件下將燒瓶中的樣品轉移到多個50ml的無菌離心管中，IOOOOg離心力離心15分鐘，在無菌條件下將上清液轉移到一個干凈的無菌容器中保存為待用上清液； 然后在每個離心管中加入Iml的無菌水、重懸浮離心管底部收集到的沉淀物，將所有離心管中的重懸浮液收集到一起成為IOml的混合液；混合液中包含有芽孢。將收集的芽孢接種于培養基、在油藏原位溫度條件下對芽孢菌進行復活培養步驟具體為將收集到的IOml的混合液作為種子，在無菌條件下接種到裝有30ml培養基的IOOml培養瓶中，密封瓶口，在樣品采集的油藏原位溫度10°C -110°C條件下，搖菌(150rmp)對芽孢菌進行復活培養7-15天，得復活培養液； 所述的培養基是指與微生物原來生長環境相匹配，并能為芽孢復活提供營養物的培養基，培養基成分為糖蜜2g, (NH4)2HPO4 O. 16g，KNO3 O. 2g，用待用上清液配制并定容到100ml，加入原油2g;121°C滅菌20分鐘高壓蒸汽滅菌，原油來自樣品采集油藏。通過分子生物學方法檢測復活的芽孢菌菌群步驟具體操作為在無菌條件下吸取5ml復活培養液于離心管中，IOOOOg離心力離心10分鐘，移除上清，在離心管中加入Iml無菌水，重懸浮離心管底沉淀； 通過DNA試劑盒FastDNA Spin Kit for Soil來抽提重懸浮液中的DNA，構建16S rDNA克隆文庫，基因測序以及微生物系統發育分析來完成對芽孢桿菌的檢測和分析。油田中大部分芽孢桿菌(ifeci77M)由于其形成芽孢的特性和檢測方法的不足而被忽視，本專利技術將傳統的微生物學和分子生物學的優點相結合，提出了一種快速檢測油藏中的芽孢桿菌的方法。本專利技術所述的方法能有效地檢測油藏中的芽孢桿菌為油藏中采用功能芽孢桿菌的發現，以及油藏中芽孢桿菌(.Bacillus)的生態學研究提供了新的可行方法。 附圖說明圖I為實施例I收集得到的某個芽孢的透射電鏡照片。具體實施例方式不同的油藏原位溫度不同，本專利技術選取了 4個不同原位溫度的油藏，每個油藏中取了注水井以及油井樣品。同時還選取了一個聚合物驅后油藏，取注水井以及油井樣品。所有實例中的樣品的共同特點是，在沒有經過本專利方法處理過的樣品中，沒有檢測到芽孢桿菌Ofeci77m)。根據本專利中的方法對上述樣品進行處理，通過多個實例來證明本專利技術中的方法的可行性。實施例I 低溫油藏中芽孢桿菌iBacillus )檢測 從新疆油田低溫No. 6油藏(25°C)分別采集了注水井T6186和油井T6073的井口樣品。以前研究報道表明，通過分子生態學方法，兩個原始樣品中沒有檢測到芽孢桿菌{Bacillus')。對該實例中的兩個樣品進行處理，具體檢測步驟為 I、油藏樣品的采集將采集的油藏樣品裝入已滅菌的樣品瓶中，裝滿樣品瓶本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟：（1）油藏樣品的采集；（2）通過高溫滅活樣品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物；（3）收集滅活后樣品中的芽孢；（4）將收集的芽孢接種于培養基、在油藏原位溫度條件下對芽孢菌進行復活培養；（5）通過分子生物學方法檢測復活的芽孢菌菌群。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張凡，佘躍惠，侯讀杰，柴陸軍，
申請(專利權)人：中國地質大學北京，
類型：發明
國別省市：