蠟樣芽孢桿菌的檢測方法及試劑盒技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)的提供一種新的蠟樣芽孢桿菌的檢測方法，該檢測方法包括：1)提取待檢測樣品中的DNA；2)將步驟1)獲得的DNA作為模板，進行實時熒光定量PCR檢測；其中，實時熒光定量PCR檢測的靶標為蠟樣芽孢桿菌murB基因。本發(fā)明專利技術(shù)還提供一種蠟樣芽孢桿菌的檢測試劑盒，所述試劑盒包括用于擴增蠟樣芽孢桿菌murB基因的引物。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于食品安全領(lǐng)域的核酸檢測。具體而言，本專利技術(shù)涉及蠟樣芽孢桿菌快速檢測的方法以及試劑盒。
技術(shù)介紹
蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)作為需氧芽孢桿菌群中的一種，無莢膜、能運動、革蘭氏陽性桿菌，芽孢能耐受100°c達30分鐘。該菌在自然界分布極廣，常見于土壤、污水和塵埃中；在16-451能生長繁殖，最適生長溫度為35°C。常因本菌污染富含碳水化合物的淀粉制品和富含蛋白質(zhì)的乳制品等食品并在其中生長繁殖而引起食物中毒。蠟樣芽孢桿菌也是人和動物的各種非腸道傳染病的條件致病菌，可引起人類患結(jié)膜炎、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、傷口感染等疾病。蠟樣芽孢桿菌主要的致病物質(zhì)是兩種對人致病的耐熱和不耐熱腸毒素、大量的活菌及代謝產(chǎn)物如磷脂酶、核酸酶、溶血素等。近年來在蠟樣芽孢桿菌作為皮膚上的創(chuàng)口感染菌的病例逐漸增多。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)也引起燒傷創(chuàng)面感染癥狀類似氣性壞疽，發(fā)展很快，出現(xiàn)肌肉壞死。有全身中毒癥狀，是由該細菌的外毒素所致。這類細菌感染，對任何抗生素無效。在食品企業(yè)，尤其是糧油加工企業(yè)，面臨著嚴重的蠟樣芽孢桿菌的污染治理問題，然而，擺在眼前的一個嚴峻問題是，蠟樣芽孢桿菌的檢測尤其是定量檢測非常困難，使該生物危害因子的防治成為空談。建立一種行之有效的食源性蠟樣芽孢桿菌的定量檢測方法，以提高對該菌的檢測速度和準確性，使受污染的食品得到及時處理，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生和口岸檢疫等中都有重要意義。然而，傳統(tǒng)的檢測方法耗時、操作繁瑣，而基于免疫學(xué)原理的產(chǎn)品存在檢測限高、特異性不強等問題。尤其是蠟樣芽孢桿菌群的6種菌，包括蠟樣芽孢桿菌(B. cereus),炭疽芽孢桿菌(B. anthracis),蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis),蕈狀芽孢桿菌(B. mycoides),假真菌樣芽孢桿菌(B. pseudomycoides)以及韋氏芽孢桿菌(B. weihenstephanensis),表型和生化特征相似度非常高,僅在產(chǎn)腸毒素種類、伴胞晶體的有無等方面存在差異，尤其是一些不產(chǎn)腸毒素或不攜帶伴胞晶體的變異菌株的存在，使該群的鑒別非常困難。為此，本專利技術(shù)人經(jīng)過長期研究，令人意外地研究出了一種以蠟樣芽孢桿菌murB為靶標的鎖核苷酸探針熒光定量快速檢測的方法，不但能有效監(jiān)控PCR擴增，而且蠟樣芽孢桿菌的種特異性強，可有效區(qū)分蠟樣芽孢桿菌群的其它芽孢桿菌，快速，檢測靈敏度高，并可以應(yīng)用于食品中蠟樣芽孢桿菌的高通量篩檢。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的第一個方面是提供一種新的蠟樣芽孢桿菌的檢測方法。該檢測方法包括1)提取待檢測樣品中的DNA ；2)將步驟I)獲得的DNA作為模板，進行實時熒光定量PCR檢測；其中，實時熒光定量PCR檢測的靶標為蠟樣芽孢桿菌murB基因。本專利技術(shù)之所以將murB基因作為檢測靶標是通過如下方法篩選得到的通過公用數(shù)據(jù)庫檢索下載搜集，建立關(guān)于蠟樣芽孢桿菌和非蠟樣的芽孢桿菌的基因庫。選取一蠟樣芽孢桿菌基因組作為目標基因組，利用程序genomecut. pi對其進行分割，片段大小為lOObp。用BLAST對分割片段與種屬內(nèi)其他蠟樣芽孢桿菌基因組進行相似性分析，利用程序cofinder, pi發(fā)掘種屬內(nèi)保守片段(即各蠟樣芽孢桿菌基因組都含有的片段)。再用BLAST對保守片段與種屬外其他非蠟樣芽孢桿菌基因組進行相似性分析，利用程序spfinder. pi發(fā)掘種屬特異片段(種屬特異片段判斷標準種屬內(nèi)保守片段與其他所有已測序微生物基因組同源區(qū)域不超過25bp)，從而初步篩選到靶點序列。運用基因組學(xué)的方法，先建立了基因組庫，再在目的蠟樣芽孢桿菌基因組中，通過在線BLAST —共篩選出了共100個特異性片段，即100個大小為IOObp的特異性DNA序列片段。將這100個特異片段經(jīng)過合并整理成87個，分別設(shè)計引物進行特異性和靈敏度的普通PCR檢測評價,最后證明murB基因?qū)?yīng)的引物特異性和靈敏度均為最佳，因此選定murB基因為檢測靶標。為了將蠟樣芽孢桿菌群的幾種菌加以區(qū)分，本專利技術(shù)通過murB基因保守位點的分析，設(shè)計合成了將murB基因特有的保守位點加以鎖核苷酸(locked nucleic acid,LNA)修飾的探針。鎖核苷酸是一種人工合成的反義寡核苷酸，能夠和靶核酸分子特異穩(wěn)定的結(jié)合，從而增加探針的熔解溫度，即Tm值，使PCR反應(yīng)的特異性和穩(wěn)定性得到加強。該鎖核苷酸探針 LNA-probe 的序列為 5’ -FAM-TGTAAT*GG*TTGTT*CG*CAA-BHQI-3'(標記為星號且?guī)聞澗€的核苷酸為鎖核苷酸)。因此，優(yōu)選地，本專利技術(shù)中，實時熒光定量PCR檢測所用的熒光探針的核苷酸序列為5’ -TGTAA1*GG*TTGT1*CG*CAA-BHQI-3'，標記為星號且?guī)聞澗€的核苷酸為鎖核苷酸。在本專利技術(shù)中，樣品是潛在含有蠟樣芽孢桿菌的離體樣品，如食品、血液、血液制品、唾液、醫(yī)療用品或藥品等。由于蠟樣芽孢桿菌是食源性致病菌，因此優(yōu)選樣品來自于食品，如樣品是食品，或者樣品是食品的細菌平板培養(yǎng)物等。需要指出的是，檢測來自于食品的樣品，屬于食品安全檢測領(lǐng)域。提取DNA以及實時熒光定量PCR檢測中所用的試劑和儀器已經(jīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握，而且目前有大量商品化的試劑和儀器可供選用。例如，在本專利技術(shù)的具體實施方式中，可以使用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒來提取菌體基因組DNA，可以使用 Taqman Universal PCR Master Mix II with UNG 試劑盒以及 ABI7500 突光定量PCR儀來進行實時熒光定量PCR檢測。但是，這些試劑不提供熒光定量PCR的引物和探針。優(yōu)選在本專利技術(shù)中，實時熒光定量PCR的引物為murB-F和murB-R，murB-F的序列為5’ -CCTTCTTCAAGTTCAAATCTCG-3’，murB-R 的序列為 5’ -GTYGTAATGACAGGTGATGGA-3 ’。探針法熒光定量PCR的反應(yīng)過程是本領(lǐng)域技術(shù)人員所能掌握的，一般為兩步法，每個循環(huán)包括在95° C的變性和60° C的延伸過程，根據(jù)本專利技術(shù)人研究，最優(yōu)選的實時熒光定量PCR的過程為40個循環(huán)，其中每個循環(huán)為95° C/15sec，60° C/lmin。探針在實時熒光定量PCR的反應(yīng)體系中的含量對實時熒光定量PCR檢測的結(jié)果有一定的影響。根據(jù)本專利技術(shù)人研究，最優(yōu)選的內(nèi)標在實時熒光定量PCR的反應(yīng)體系中的含量為 0.I μ mol/Lo本專利技術(shù)的另一個方面是提供一種蠟樣芽孢桿菌的檢測試劑盒，包括用于擴增蠟樣芽孢桿菌murB基因的引物。優(yōu)選地，所述引物為引物murB-F(序列為5’ -CCTTCTTCAAGTTCAAATCTCG-3’)和 murB-R (序列為 5’ -GTYGTAATGACAGGTGATGGA-3’)。另外，本專利技術(shù)所提供的試劑盒還可包括鎖核苷酸熒光探針，所述熒光探針的核苷酸序列為5’ -TGTAAI*G￡*TTGTI*C￡*CAA-BHQl-3’，標記為星號且?guī)聞澗€的核苷酸為鎖核苷酸。檢測試劑盒還可以包括提取DNA和/或?qū)崟r熒光定量PCR檢測中所用的試劑。這些試劑可以通過市場渠道購買，如可以將現(xiàn)有的提取DNA和/或?qū)崟r熒光定量PCR檢測試劑盒中的試劑進行分裝。本專利技術(shù)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
蠟樣芽孢桿菌的檢測方法，其特征在于，所述方法包括：1)提取待檢測樣品中的DNA；2)將步驟1)獲得的DNA作為模板，進行實時熒光定量PCR檢測；其中，實時熒光定量PCR檢測的靶標為蠟樣芽孢桿菌murB基因。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：施春雷，楊捷琳，史賢明，劉斌，潘良文，袁辰剛，
申請(專利權(quán))人：上海交通大學(xué)，中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局，
類型：發(fā)明
國別省市：