利用聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物檢測(cè)核酸序列的方法及產(chǎn)物技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種利用聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物檢測(cè)核酸序列的方法，屬于功能高分子領(lǐng)域。該方法的過(guò)程包括將聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯熒光共聚物經(jīng)鹵代烷質(zhì)子化制成帶有正電荷的聚電解質(zhì)，并將這種聚電解質(zhì)與直鏈或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA作用形成新型熒光探針來(lái)檢測(cè)目標(biāo)DNA的方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于：是一種制備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)易、行之有效的新型熒光探針，將為穩(wěn)定、高效、特異性識(shí)別核酸分子開(kāi)辟一種新途徑并在揭示疾病與基因變異等方面具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

一種利用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物檢測(cè)核酸序列的方法，特別是涉及一種利用非共軛熒光共聚物與直鏈或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA通過(guò)靜電作用形成新型的分子探針來(lái)檢測(cè)目標(biāo)DNA的方法，屬于功能高分子

技術(shù)介紹
功能高分子在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，特別是熒光高分子在分析、檢測(cè)生物大分子方面的研究已引起國(guó)內(nèi)外科學(xué)工作者的密切關(guān)注，此研究方向也是國(guó)際上前沿科學(xué)的研究熱點(diǎn)。一些小分子熒光染料如吖啶、菲啶類染料、菁類染料、熒光素和羅丹明類染料、噻嗪和噁嗪類染料等是目前應(yīng)用較廣的核酸熒光探針，這些簡(jiǎn)單的熒光染料對(duì)核酸分子的序列不能特異識(shí)別，屬于非特異性的小分子探針。為了克服上述不足，科學(xué)工作者將熒光基團(tuán)通過(guò)共價(jià)鍵連結(jié)到單鏈寡聚核酸分子上，例如Saito、Hrdlicka等人分別設(shè)計(jì)了一種芘標(biāo)記到核酸上的線性熒光探針，發(fā)現(xiàn)這種熒光標(biāo)記的分子探針與堿基序列互補(bǔ)的核酸分子通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)法則形成雜化復(fù)鏈,祀向雜化前后的突光性能發(fā)生重大變化，從而實(shí)現(xiàn)了熒光探針特異性識(shí)別核酸分子(J. Am. Chem. Soc.，2004, 126，4820 ；Chem.Commun. , 2010, 46, 4929)。Wang等人也設(shè)計(jì)了一種花標(biāo)記HNA及RNA線性探針，發(fā)現(xiàn)革巴向雜化后芘單體的熒光強(qiáng)度增加而激基復(fù)合物的熒光強(qiáng)度劇烈下降，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的檢測(cè)(ChemBioChem.，2009，10，1175)。然而相對(duì)于線性的分子探針，它是一種莖端有一對(duì)熒光基團(tuán)和淬滅集團(tuán)修飾的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的分子探針，也稱為分子信標(biāo)，具有一些關(guān)鍵的優(yōu)點(diǎn)提高錯(cuò)配目標(biāo)的熱識(shí)別及降低假陽(yáng)性信號(hào)的風(fēng)險(xiǎn)。因而在生物研究領(lǐng)域受到更為廣泛的關(guān)注。Tan等人在分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)及應(yīng)用方面做出了很多杰出的成果，包括生物傳感器的設(shè)計(jì)、核酸的檢測(cè)及生命系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)等等(J. Am. Chem. Soc.，2008, 130, 8351. ；Angew.Chem. , 2001, 113, 416;Angew. Chem. Int. Ed. , 2001, 40, 402. ；Anal. Chem. , 2005, 77, 4713)。然而，研究結(jié)果表明標(biāo)記型熒光探針檢測(cè)核酸分子的缺點(diǎn)在于熒光基團(tuán)的引入會(huì)降低熒光探針與靶向分子雜化雙鏈的熱穩(wěn)定性，從而會(huì)降低熒光探針的檢測(cè)精度；標(biāo)記型熒光探針需要將熒光基團(tuán)通過(guò)共價(jià)鍵連結(jié)到寡聚核酸分子鏈上以實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別核酸分子，而其中的合成與操作較繁雜。近幾年，水溶性的熒光共軛聚電解質(zhì)作為非標(biāo)記性的熒光探針熒光在生物傳感應(yīng)用領(lǐng)域上得到越來(lái)越多的研究者的親睞。He等人報(bào)道了一種用共軛聚電解質(zhì)制備的非標(biāo)記型的多路復(fù)用的DNA探針來(lái)檢測(cè)DNA雜交時(shí)信號(hào)的轉(zhuǎn)輸(J. Am. Chem.Soc.，2009, 131，3432)。Bazan等人通過(guò)用一種水溶性的陽(yáng)離子共軛聚電解質(zhì)設(shè)計(jì)均質(zhì)的熒光探針(Chem. Mater.，2004, 16，4467)。王樹(shù)等人也報(bào)道了一種充分利用分子信標(biāo)在錯(cuò)配識(shí)別的優(yōu)勢(shì)及共軛聚電解質(zhì)較高的量子產(chǎn)率的性質(zhì)而制備的檢測(cè)DNA的分子探針，以及還報(bào)道了用包含有共軛聚電解質(zhì)的熒光膠束檢測(cè)DNA和酶等等(Langmuir.，2008, 24，12138 ；Langmuir.，2009，25，13737 ；Angew. Chem. Int. Ed.，2009，48，5316)。這些熒光共軛聚電解質(zhì)可通過(guò)靜電作用與生物大分子結(jié)合，通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET或電子轉(zhuǎn)移、分析物誘導(dǎo)熒光高分子聚集態(tài)結(jié)構(gòu)變化、分析物誘導(dǎo)熒光高分子構(gòu)象變化等可導(dǎo)致這種熒光高分子的光學(xué)性能改變，進(jìn)而對(duì)生物大分子進(jìn)行檢測(cè)。雖然共軛聚電解質(zhì)有廣泛地應(yīng)用為生物傳感器的材料，但非共軛熒光聚電解質(zhì)作為生物傳感器材料尚未見(jiàn)報(bào)道。本專利專利技術(shù)了一種新的非標(biāo)記的熒光聚電解質(zhì)，將其通過(guò)靜電作用與DNA形成一種新型的非標(biāo)記的熒光探針，這種熒光聚合物克服了小分子熒光探針的非特異性識(shí)別及標(biāo)記性熒光探針的制備繁雜等缺點(diǎn)，為生物大分子的檢測(cè)開(kāi)辟了一種新的測(cè)試方法。申請(qǐng)人:申請(qǐng)的為一種利用丙烯酸芘甲酯制備水溶性共聚物的方法，申請(qǐng)?zhí)?01110430560. 7的專利申請(qǐng)，公開(kāi)了未質(zhì)子化之前的聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物的合成方法，本申請(qǐng)?jiān)诖巳囊谩?br>技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種合成方法簡(jiǎn)單，且含有突光量子產(chǎn)率較高的花突光基團(tuán)的非共軛聚電解質(zhì)，通過(guò)靜電作用結(jié)合直鏈或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA形成新型的分子探針來(lái) 檢測(cè)目標(biāo)DNA的方法。本專利技術(shù)特點(diǎn)在于利用非共軛聚電解質(zhì)與DNA結(jié)合，形成新型的分子探針，該非共軛聚電解質(zhì)合成路線簡(jiǎn)單易行，所合成的聚合物的側(cè)鏈上引入了熒光量子產(chǎn)率較高的且對(duì)周?chē)h(huán)境有很強(qiáng)的敏感性的芘熒光基團(tuán)和親水性的胺基基團(tuán)，使該聚電解質(zhì)能很好地應(yīng)用于生物等方面的檢測(cè)。本專利技術(shù)的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本專利技術(shù)利用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物經(jīng)鹵代烷質(zhì)子化制成帶正電荷的含芘熒光基團(tuán)的聚電解質(zhì)，并將這種聚電解質(zhì)與直鏈或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈DNA作用形成新型熒光探針來(lái)檢測(cè)目標(biāo)DNA。一種用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物檢測(cè)核酸序列的方法，按照下述步驟進(jìn)行( I)共聚物質(zhì)子化的反應(yīng)將聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物和適量的碘甲烷按物質(zhì)的量為1:3溶于有機(jī)溶劑四氫呋喃中,在常溫下反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后,將溶劑四氫呋喃過(guò)濾掉，然后再用索氏提取器提取產(chǎn)物，其中提取劑為四氫呋喃，提取時(shí)間為12小時(shí)，最后再將最終的熒光聚電解質(zhì)在真空干燥箱中以70°C溫度干燥12小時(shí)，合成路線如圖I所示。(2)新型熒光分子探針的配制用緩沖溶液PBS (10Mm，pH=7.4)將(I)中制得聚電解質(zhì)稀釋制成原溶液，同樣，分別用緩沖溶液PBS( IOMm, pH=7. 4)將直鏈結(jié)構(gòu)的單鏈DNAl或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈DNA2溶解，最后，再取適當(dāng)?shù)木垭娊赓|(zhì)溶液與DNAl或者DNA2溶液混合，通過(guò)靜電作用行成新型的直鏈或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的熒光分子探針。(3) DNA雜交樣品的配制用緩沖溶液PBS (10Mm，pH=7. 4)稀釋不同序列的DNA3，DNAa，DNAc，DNAt。其中DNA3與DNAl完全互補(bǔ)配對(duì)，與DNAa，DNAc7DNAt完全不互補(bǔ)；DNA1與DNA2部分互補(bǔ)配對(duì)，與DNAa, DNAc, DNAt完全不互補(bǔ)。分別取一定量溶解好的DNA3，DNAa, DNAc, DNAt加入(2)中配好的熒光探針樣品溶液中，最后將配好的所有溶液經(jīng)過(guò)5min的90°C的熱處理，再在40°C下保溫半小時(shí)。所述的步驟(I)所合成的聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯聚電解質(zhì)結(jié)構(gòu)為權(quán)利要求1.一種利用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物檢測(cè)核酸序列的方法，所述的方法步驟包括 (1)共聚物的質(zhì)子化 將聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯和碘甲烷溶于有機(jī)溶劑四氫呋喃中，在常溫下反應(yīng)24小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑四氫呋喃過(guò)濾掉，然后再用索氏提取器提取產(chǎn)物，其中提取劑為四氫呋喃，提取時(shí)間為12小時(shí)，最后再將熒光聚電解質(zhì)P (DMAEMA+-C0-Py)在真空干燥箱中以70°C溫度干燥12小時(shí)； (2)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種利用聚丙烯酸芘甲酯？聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物檢測(cè)核酸序列的方法，所述的方法步驟包括：（1）共聚物的質(zhì)子化：將聚丙烯酸芘甲酯？聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯和碘甲烷溶于有機(jī)溶劑四氫呋喃中，在常溫下反應(yīng)24小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑四氫呋喃過(guò)濾掉，然后再用索氏提取器提取產(chǎn)物，其中提取劑為四氫呋喃，提取時(shí)間為12小時(shí)，最后再將熒光聚電解質(zhì)P(DMAEMA+？co？Py)在真空干燥箱中以70℃溫度干燥12小時(shí)；（2）新型熒光分子探針的配制：用緩沖溶液PBS：10Mm，pH=7.4，將（1）中制得聚電解質(zhì)稀釋制成原溶液，同樣，分別用緩沖溶液PBS：10Mm,pH=7.4，將直鏈結(jié)構(gòu)的單鏈DNA1或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈DNA2溶解，最后，再取適當(dāng)?shù)木垭娊赓|(zhì)溶液與DNA1或者DNA2溶液混合，通過(guò)靜電作用行成新型的直鏈或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的熒光分子探針；（3）DNA雜交樣品的配制：用緩沖溶液PBS：10Mm,pH=7.4，稀釋不同序列的DNA3，DNAa，DNAc，DNAt；其中DNA3與DNA1完全互補(bǔ)配對(duì)，與DNAa，DNAc，DNAt完全不互補(bǔ)；DNA1與DNA2部分互補(bǔ)配對(duì)，與DNAa，DNAc，DNAt完全不互補(bǔ)；分別取一定量溶解好的DNA3，DNAa，DNAc，DNAt加入（2）中配好的熒光探針樣品溶液中，最后將配好的所有溶液經(jīng)過(guò)5分鐘的90℃的熱處理，再在40℃下保溫半小時(shí)。...

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王國(guó)杰，楊領(lǐng)葉，趙敏，董杰，張瑞辰，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京科技大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：