一種石斛多糖含量的測(cè)定方法及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種測(cè)定石斛多糖含量的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)采用熱水浸提法提取石斛粗多糖、采用Sevag法和透析法脫蛋白獲得石斛精多糖，通過(guò)測(cè)定一種石斛的換算因子，依據(jù)此換算因子測(cè)定其他不同來(lái)源的石斛多糖的含量，不需要重新制備粗多糖和精多糖，能有效地降低材料的使用成本，并能夠批量的測(cè)定多種石斛的多糖含量，使石斛多糖的檢測(cè)更為方便、簡(jiǎn)捷、科學(xué)。本發(fā)明專利技術(shù)得到的石斛精多糖純度高、雜質(zhì)少；與現(xiàn)有超聲波提取、酸堿提取等方法相比，本發(fā)明專利技術(shù)的測(cè)定方法能夠精確地檢測(cè)石斛多糖的含量，給石斛品種的鑒定提供參考，也給石斛育種、生產(chǎn)和市場(chǎng)消費(fèi)提供有效的指引。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種石斛多糖含量的測(cè)定方法及其應(yīng)用
本專利技術(shù)屬于中藥及其提取物的化學(xué)分析
，特別涉及一種石斛多糖含量的測(cè)定方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
多糖(polysaccharide)由多個(gè)單糖分子縮合、失水而成,是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量從幾萬(wàn)到幾千萬(wàn)不等。多糖在自然界分布極廣，亦很重要，有的是構(gòu)成動(dòng)植物骨架結(jié)構(gòu)的組成成分，如纖維素；有的是作為動(dòng)植物儲(chǔ)藏的養(yǎng)分，如糖原和淀粉；有的具有特殊的生物活性，像人體中的肝素有抗凝血作用，肺炎球菌細(xì)胞壁中的多糖有抗原作用。近年來(lái)多糖研究越來(lái)越深入，逐漸成為生命科學(xué)研究的前沿。多糖的測(cè)定方法有很多種，如斐林法、蒽酮_硫酸法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、酶法和苯酚_硫酸法等，各測(cè)定方法有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，如毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法精密度較高但需要多糖純品，對(duì)測(cè)定樣品的要求高，成本較高；蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法等測(cè)定多糖時(shí)蛋白的干擾比較明顯。由于苯酚-硫酸法操作簡(jiǎn)便，精確度較好， 是目前多糖測(cè)定中較常使用的一種方法。石斛是我國(guó)名貴的中藥材，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，具有滋陰清熱、生津益胃、 強(qiáng)身等功效。石斛多糖是石斛的主要藥效成分之一，有抗腫瘤、降血糖、抗衰老和增強(qiáng)免疫等作用。石斛精多糖的獲得是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，需要經(jīng)過(guò)熱水浸提、粗多糖提取以及蛋白去除等步驟，其中制備Ig精多糖需要耗費(fèi)500g左右鮮石斛，傳統(tǒng)的制備及測(cè)定方法具有耗時(shí)、耗力和耗材的缺點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種石斛多糖含量的測(cè)定方法。本專利技術(shù)的另一目的在于提供所述石斛多糖含量的測(cè)定方法的應(yīng)用。本專利技術(shù)的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種石斛多糖含量的測(cè)定方法，包括以下步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別吸取0、0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. O、I. 2、I. 4、I. 6,2. Oml 的 O. 05mg · ml/1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,各加蒸懼水補(bǔ)至2. Oml,然后各加6wt%重蒸苯酹I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. 0ml，搖勻，靜置5min后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于 490nm處測(cè)定吸光度；以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程；換算因子(f)的測(cè)定取50μ g πιΓ1石斛精多糖溶液O. 05 1ml，加蒸餾水補(bǔ)足至2. Oml,各加6wt%重蒸苯酹溶液I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. Oml,搖勻，靜置5min 后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于490nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算石斛精多糖溶液的濃度；計(jì)算換算因子f :f = Cs/C，其中，Cs為石斛精多糖溶液的實(shí)際濃度，C為回歸方程計(jì)算石斛精多糖溶液的濃度；石斛樣品溶液中石斛多糖含量的測(cè)定吸取石斛樣品溶液O. 05 1ml，各加蒸懼水補(bǔ)至2. Oml,然后各加6wt%重蒸苯酹I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. Oml,搖勻， 靜置5min后置沸水浴中加熱20min,冷卻至室溫，于490nm處測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算石斛樣品溶液中石斛多糖的濃度，由下述公式計(jì)算石斛樣品溶液中石斛多糖含量(X) X=fXC，XDX100%/ff ;式中f-換算因子(即石斛多糖相當(dāng)于葡萄糖的校正系數(shù))，c’ -由回歸方程得到的石斛樣品溶液中的葡萄糖含量，D-樣品(石斛干燥粉末)測(cè)定中的稀釋倍數(shù)，W-石斛干燥粉末的質(zhì)量；所述的石斛樣品溶液優(yōu)選采用以下方法進(jìn)行制備將石斛粉末按質(zhì)量體積比 lg/100 150ml加入80wt%乙醇中(B卩Ig石斛粉末加入100 150ml 80wt%乙醇)，80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 lh，抽濾后取濾渣；往濾渣中按質(zhì)量體積比lg/100 150ml加入蒸懼水(即Ig濾洛加入100 150ml蒸懼水),80 90°C回流提取2 3次,每次O. 5 lh，抽濾后取濾液，合并濾液，用蒸餾水定容至50mL，搖勻，得到石斛樣品溶液；所述的石斛粉末優(yōu)選為過(guò)60目篩的干燥石斛粉末；所述的石斛精多糖溶液優(yōu)選采用以下方法進(jìn)行制備取石斛精多糖，加蒸餾水配制成50 μ g · πιΓ1的石斛精多糖溶液；所述的石斛精多糖優(yōu)選采用以下方法進(jìn)行制備取石斛粉末，按質(zhì)量體積比lg/ΙΟ 15ml加入石油醚(S卩Ig石斛粉末加入10 15ml石油醚)，80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 lh，抽濾后取濾渣A ;按質(zhì)量體積比 lg/ΙΟ 15ml往濾禮:A中加入80wt%乙醇(B卩Ig濾禮:加入10 15ml 80wt%乙醇),80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 lh，抽濾后取濾渣B ;于60°C將濾渣B烘干，得到脫脂干粉；按質(zhì)量體積比lg/ΙΟ 15ml往脫脂干粉加入蒸餾水(即Ig脫脂干粉加入10 15ml 蒸餾水)，80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 lh，抽濾后取濾液，合并濾液，60°C減壓濃縮旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，收集濃縮液；往濃縮液中加入4°C預(yù)冷無(wú)水乙醇至溶液含醇量為80wt%，靜置過(guò)夜，離心，收集沉淀，干燥，得到石斛粗多糖；取石斛粗多糖，配制成40mg · mr1的石斛粗多糖溶液；按體積比O. 4 :1往 40mg · πιΓ1石斛粗多糖溶液中加入Img · πιΓ1的胰蛋白酶，得到混合液，37°C恒溫處理5h后于95°C滅活5min,加入Sevag溶液,常溫震蕩培養(yǎng)5min后于10°C、3500rpm離心5min,保存上層溶液，取下層溶液，加入Sevag溶液，重復(fù)振蕩培養(yǎng)和離心操作3次，合并上層溶液，用蒸餾水過(guò)夜透析后加入預(yù)冷無(wú)水乙醇至溶液含醇量為80wt%，靜置過(guò)夜，離心，收集沉淀，干燥，得到石斛精多糖；所述的石斛粉末優(yōu)選為過(guò)60目篩的干燥石斛粉末；所述的石油醚優(yōu)選為沸點(diǎn)60 90°C的石油醚；所述的濃縮優(yōu)選于60°C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20 50ml ；所述的預(yù)冷無(wú)水乙醇優(yōu)選為4°C無(wú)水乙醇；所述的靜置過(guò)夜的溫度優(yōu)選為4°C ；所述的離心優(yōu)選為于4°C、12, OOOrpm離心5min ；所述的干燥的條件優(yōu)選為_80°C冷凍干燥72h ；5所述的石斛粗多糖溶液優(yōu)選采用以下方法進(jìn)行配制將石斛粗多糖加入蒸餾水中，80°C加熱溶解后冷卻至室溫，即得；所述的Sevag溶液優(yōu)選采用以下方法進(jìn)行配制將氯仿和正丁醇按體積比為4 1 混合均勻，得到Sevag溶液；所述的Sevag溶液的體積優(yōu)選為所述的混合液的體積的1/3 ；所述的振蕩培養(yǎng)的頻率優(yōu)選為1，OOOrpm ；所述的過(guò)夜透析優(yōu)選采用截留分子量7500D的透析袋；過(guò)夜透析的作用在于除去無(wú)機(jī)鹽、小分子雜質(zhì)及色素；所述石斛多糖含量的測(cè)定方法可應(yīng)用于測(cè)定各種石斛藥材如鐵皮石斛和金釵石斛的石斛多糖的含量。本專利技術(shù)相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果 本專利技術(shù)采用熱水浸提法提取石斛粗多糖、采用Sevag法和透析法脫蛋白獲得石斛精多糖，所得的石斛精多糖純度高、雜質(zhì)少；與現(xiàn)有超聲波、酸堿提取等方法相比，本專利技術(shù)通過(guò)測(cè)定一種石斛的換算因子，依據(jù)此換算因子測(cè)定其他不同來(lái)源的石斛多糖的含量，不需要重新制備粗多糖和精多糖，能有效地降低材料的使用成本，并能夠批量的測(cè)定多種石斛的多糖含量，使石斛多糖的檢測(cè)更為方便、簡(jiǎn)捷、科學(xué)。同時(shí)，本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種石斛多糖含量的測(cè)定方法，其特征在于包括以下步驟：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0ml的0.05mg·mL？1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，各加蒸餾水補(bǔ)至2.0ml，然后各加6wt%重蒸苯酚1.0ml，搖勻后加入98wt%濃硫酸5.0ml，搖勻，靜置5min后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于490nm處測(cè)定吸光度；以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程；換算因子的測(cè)定：取50μg·ml？1石斛精多糖溶液0.05～1ml，加蒸餾水補(bǔ)足至2.0ml，各加6wt%重蒸苯酚溶液1.0ml，搖勻后加入98wt%濃硫酸5.0ml，搖勻，靜置5min后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于490nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算石斛精多糖溶液的濃度；計(jì)算換算因子f：f＝Cs/C，其中，Cs為石斛精多糖溶液的實(shí)際濃度，C為回歸方程計(jì)算石斛精多糖溶液的濃度；石斛樣品溶液中石斛多糖含量的測(cè)定：吸取石斛樣品溶液0.05～1ml，各加蒸餾水補(bǔ)至2.0ml，然后各加6wt%重蒸苯酚1.0ml，搖勻后加入98wt%濃硫酸5.0ml，搖勻，靜置5min后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于490nm處測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算石斛樣品溶液中石斛多糖的濃度，由下述公式計(jì)算石斛樣品溶液中石斛多糖含量X：X=f×C’×D×100%/W；式中：f？？換算因子，C’？？由回歸方程得到的石斛樣品溶液中的葡萄糖含量，D？？石斛干燥粉末測(cè)定中的稀釋倍數(shù)，W？？石斛干燥粉末的質(zhì)量。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種石斛多糖含量的測(cè)定方法，其特征在于包括以下步驟 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別吸取 0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. O、I. 2、I. 4、I. 6,2. Oml 的O. 05mg · ml/1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,各加蒸懼水補(bǔ)至2. Oml,然后各加6wt%重蒸苯酹I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. 0ml，搖勻，靜置5min后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于490nm處測(cè)定吸光度；以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程； 換算因子的測(cè)定取50μ g -mr1石斛精多糖溶液O. 05 1ml，加蒸餾水補(bǔ)足至2. Oml,各加6wt%重蒸苯酹溶液I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. Oml,搖勻,靜置5min后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于490nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算石斛精多糖溶液的濃度；計(jì)算換算因子f :f = Cs/C，其中，Cs為石斛精多糖溶液的實(shí)際濃度，C為回歸方程計(jì)算石斛精多糖溶液的濃度； 石斛樣品溶液中石斛多糖含量的測(cè)定吸取石斛樣品溶液O. 05 1ml，各加蒸餾水補(bǔ)至2. Oml，然后各加6wt%重蒸苯酌· I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. Oml,搖勻，靜置5min后置沸水浴中加熱20min,冷卻至室溫，于490nm處測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算石斛樣品溶液中石斛多糖的濃度，由下述公式計(jì)算石斛樣品溶液中石斛多糖含量X :X=fXC，XDX100%/ff ; 式中f-換算因子，C’ -由回歸方程得到的石斛樣品溶液中的葡萄糖含量，D-石斛干燥粉末測(cè)定中的稀釋倍數(shù)，W-石斛干燥粉末的質(zhì)量。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的石斛多糖含量的測(cè)定方法，其特征在于所述的石斛樣品溶液采用以下方法進(jìn)行制備將石斛粉末按質(zhì)量體積比lg/100 150ml加入80wt%乙醇中，80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 lh，抽濾后取濾渣；往濾渣中按質(zhì)量體積比lg/100 150ml加入蒸懼水,80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 Ih,抽濾后取濾液，合并濾液，用蒸餾水定容至50mL，搖勻，得到石斛樣品溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的石斛多糖含量的測(cè)定方法，其特征在于所述的石斛精多糖采用以下方法進(jìn)行制備 取石斛粉末，按質(zhì)量體積比lg/ΙΟ 15ml加入石油醚，80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 lh，抽濾后取濾渣A ;按質(zhì)量體積比lg/ΙΟ 1...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王再花，朱根發(fā)，葉慶生，章金輝，操君喜，孫延?xùn)|，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，華南師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：