本發明專利技術公開了楊樹菇凝集素AAL-2及其編碼基因、其制備方法和應用。本發明專利技術采用親和層析方法從楊樹菇（Agrocybe?aegerita）總蛋白中分離得到凝集素蛋白AAL-2，其氨基酸序列為SEQIDNO：2所示，編碼該蛋白的核苷酸序列為SEQIDNO：1所示。細胞試驗表明,本發明專利技術所分離楊樹菇凝集素AAL-2具有優異的殺傷腫瘤細胞活性，能夠引起肝癌細胞發生顯著性的凋亡。動物實驗表明，AAL-2對腫瘤有較好的治療效果。糖芯片技術檢測結果顯示,AAL-2優先結合以N-乙酰葡萄糖胺為末端的糖或糖蛋白，可將其作為檢測與N-乙酰葡萄糖胺相關的病癥試劑或作為檢測N-乙酰葡萄糖胺相關糖結構的試劑。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種從真菌中分離到的凝集素及其編碼基因，尤其涉及從楊樹菇(Agrocybe aegerita)中分離到的凝集素AAL-2及其編碼基因，本專利技術還涉及楊樹燕凝集素AAL-2的分離方法及其在抗腫瘤或檢測與N-乙酰葡萄糖胺相關的病癥及與N-乙酰葡萄糖胺相關糖結構中的應用，屬于楊樹菇凝集素的分離和應用領域。
技術介紹
藥用真菌在東方因其獨特的藥用價值(尤其是它的抗腫瘤活性)有著兩千余年的歷史。直到上世紀50年代，隨著技術的成熟和多糖等有效成分的分離鑒定，藥用真菌的藥 用價值才逐漸被歐美研究者所重視，越來越多的藥用真菌活性成分在動物和臨床試驗中進行篩選并得到驗證，成為抗腫瘤藥物的篩選寶庫。楊樹燕(Agrocybe aegerita),又名柱狀田頭燕、楊樹燕、柳松鸞等，隸屬于真菌門、擔子菌綱、傘菌目、糞銹傘科、田蘑屬。楊樹菇富含人體必需的八種氨基酸，其中賴氨酸高達I. 75%，其營養價值超過香菇、金針菇等其它食用菌，同時又具有獨特的藥用價值，民間常將其用于抗癌、降血壓，治療胃冷、腎炎、水腫等，具有獨特療效，但其中的藥理成分并不明確。原發性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其全球發病率和死亡率分別列第七位和第三位。中國肝癌的發病率為25. 7/10萬，僅次于肺癌和胃癌，而其病死率高達23. 7/10萬，在中國的腫瘤病死率中列第二位。目前公認的肝癌診斷療法有超聲波診斷，皮下乙醇注射，放化療以及手術切除等方法，但是肝癌的復發率和轉移率較高。因此，亟待尋找更加有效抑制肝癌或殺死肝癌細胞的藥物或方法。凝集素(lectin)是自然界中廣泛存在的一種非免疫來源的蛋白，能夠可逆的結合多種糖或糖蛋白，并且這種結合不同于酶和底物的結合方式。至今，人類已經分離出數百種凝集素，每種凝集素都有其獨特的生化特性、糖結合特異性和廣泛的生物活性，譬如抗腫瘤活性，抗真菌活性和抗病毒活性等。孫慧等通過陰離子交換層析的方法從楊樹菇總蛋白中分離得到凝集素AAL，并驗證其具有廣譜的抗腫瘤效果，對直腸癌、宮頸癌、胃癌、血癌細胞等癌細胞均有殺傷活性，其中，對血癌細胞HL60的殺傷活性高于陽性對照藥阿霉素(孫慧等，楊樹菇凝集素AAL具有抗腫瘤活性.Biochem. J. (2003) 374，321-327)。
技術實現思路
本專利技術目的之一是提供一種從楊樹燕(Agrocybe aegerita)中分離到的新的凝集素；本專利技術目的之二是提供一種從楊樹菇分離或制備上述凝集素的方法；本專利技術目的之三是提供編碼上述所分離的楊樹菇凝集素的cDNA ；本專利技術目的之四是提供上述楊樹菇凝集素及其編碼基因的藥理用途；本專利技術的上述目的是通過以下技術方案來實現的 本專利技術通過親和層析方法從楊樹菇總蛋白中分離得到一種新的凝集素，命名為楊樹菇凝集素AAL-2，其氨基酸序列為以下(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而獲得的仍具有楊樹燕(Agrocybe aegerita)凝集素AAL功能的多肽變異體。優選的，本專利技術所述的楊樹燕(Agrocybe aegerita)凝集素AAL-2為SEQID NO 2所示的氨基酸序列。本專利技術中所述的“多個”通常意味著通常為1-50個，較佳的1-30個，更佳的1-20個，最佳的為2 4個，這些取決于凝集素AAL-2三維結構中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述的“替換”是指分別用不同的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基；例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸序列進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。所述 的“缺失”是指氨基酸序列的改變，其中分別缺少一個或多個氨基酸殘基；所述的“插入”是指氨基酸序列的改變，相對天然分子而言，所述改變導致添加一個或多個氨基酸殘基或者在C末端和/或N末端添加一個或多個(通常為20個以內，較佳的為10個以內，更佳的為5個以內)氨基酸。本專利技術所述的楊樹菇凝集素AAL-2的多肽變異體包括同源序列變異體、保守型變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹雜交條件下能與楊樹燕凝集素AAL-2核苷酸序列雜交的DNA所編碼的蛋白以及利用抗楊樹菇凝集素AAL-2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。所述“嚴謹雜交條件”意指在所屬領域中已知的低離子強度和高溫的條件。通常，在嚴謹條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測程度比與其它序列雜交的可檢測程度更高(例如超過本底至少2倍。嚴謹雜交條件是序列依賴性的，在不同的環境條件下將會不同，較長的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴謹性或洗滌條件可鑒定與探針100%互補的祀序列。對于核酸雜交的詳盡指導可參考有關文獻(Tijssen,Techniques inBiochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Probes," Overviewof principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays. 1993)。更具體的，所述嚴謹條件通常被選擇為低于特異序列在規定離子強度pH下的熱熔點(Tm)約5-10°C。TmS在平衡狀態下50%與目標互補的探針雜交到目標序列時所處的溫度(在指定離子強度、PH和核酸濃度下)(因為目標序列過量存在，所以在^下在平衡狀態下50%的探針被占據)。嚴謹條件可為以下條件其中在PH7. O到8. 3下鹽濃度低于約I. OM鈉離子濃度，通常為約O. 01到I. OM鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對于短探針(包括(但不限于)10到50個核苷酸)而言為至少約30°C，而對于長探針(包括(但不限于)大于50個核苷酸)而言為至少約60°C。嚴謹條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩定劑來實現。對于選擇性或特異性雜交而言，正信號可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。作為參考，所述的“嚴謹雜交條件”可如下50%甲酰胺，5XSSC和1% SDS，在42°C下培養；或5XSSC,1% SDS，在65°C下培養，在0. 2XSSC中洗滌和在65°C下于0. 1% SDS中洗滌。所述洗滌可進行5、15、30、60、120分鐘或更長時間。本專利技術所述的多肽變異體可由遺傳多態性或人為操作產生，這些操作方法通常為本領域所了解。例如，可通過DNA的突變來制備SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的變異體或片段，其中，由于誘變或改變多核苷酸的方法為本領域普通技術人員所習知。本專利技術還提供了其它多肽，如包含楊樹菇凝集素AAL-2或其片段的融合蛋白。本專利技術還包括楊樹菇凝集素AAL-2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然楊樹菇凝集素AAL-2多肽的差異可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響氨基酸序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其它已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物以及具有非天然存活的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。所述的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
楊樹菇（Agrocybe？aegerita）凝集素AAL？2，其特征在于,其氨基酸為以下（a）或（b）所示：（a）SEQ？ID？NO：2所示的氨基酸序列；或（b）將SEQ？ID？NO：2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而獲得的仍具有SEQ？ID？NO：2所示氨基酸功能的衍生序列。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫慧，姜帥，谷變利，陳義杰，余國軍，尹亞琳，
申請(專利權)人：武漢奧力生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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