本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)及制備方法，小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，以殼聚糖為傳遞主體，以所述傳遞系統(tǒng)的總重量為基準(zhǔn)，含有0.5~2.0%的小分子干擾核糖核酸和10%～25%的多聚磷酸鈉，所述納米粒凍干前后粒徑為60~200nm，Zeta電勢(shì)10～70mV。本發(fā)明專利技術(shù)能有效的將siRNA遞送進(jìn)入鼻咽癌組織，靶向性好，給藥劑量小，可避免siRNA注射給藥后，在到達(dá)鼻咽部之前的降解和其他組織的攝取。CS納米粒可有效保護(hù)siRNA不被鼻腔液破壞。本發(fā)明專利技術(shù)的siRNA傳遞系統(tǒng)，可在鼻咽癌細(xì)胞中有效抑制相關(guān)基因。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體為一種用于治療鼻咽癌的經(jīng)鼻給藥小核酸納米載體遞藥系統(tǒng)的制備方法。
技術(shù)介紹
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，占頭頸部腫瘤發(fā)病率首位。好發(fā)于兩廣、福建及嘉陵江流域，近年來(lái)發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)。放射治療是鼻咽癌的基本治療手段，可以取得較高的局部控制率，但由于鼻咽癌生長(zhǎng)迅速以及高轉(zhuǎn)移性，使該病存在著較高的治療失敗率，主要原因是局部區(qū)域復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。是否能夠?qū)⒒蛑委煈?yīng)用于鼻咽癌，是人們十分關(guān)注的問(wèn)題。小干擾RNA(SiRNA)由21 23個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成，可在細(xì)胞質(zhì)中特異性結(jié)合與其堿基對(duì)互補(bǔ)的信使RNA(mRNA)，經(jīng)核酸酶降解mRNA而阻斷其編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)，即通過(guò)RNA 干擾(RNAi)實(shí)現(xiàn)基因沉默。該過(guò)程既可沉默細(xì)胞內(nèi)有害基因，又可沉默外來(lái)病毒基因， 因此，siRNA作為藥物在癌癥和流感、肝炎等病毒感染疾病治療領(lǐng)域有重要科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。但是，親水性陰離子siRNA易被快速?gòu)难貉h(huán)中清除，難以跨越表面負(fù)電的疏水性細(xì)胞膜，易被核酸酶降解，需要安全高效的載體釋放系統(tǒng)保護(hù)并高效運(yùn)送進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮功能。目前siRNA的非病毒載體主要為陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子高分子，如聚乙烯亞胺 (PEI)和殼聚糖。盡管脂質(zhì)體易與細(xì)胞膜融合，但不穩(wěn)定且有較強(qiáng)細(xì)胞和體內(nèi)毒性；PEI質(zhì)子緩沖能力利于胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，但也有較強(qiáng)的細(xì)胞和體內(nèi)毒性。殼聚糖(Chitosan, CS)是一種從奸皮、蟹殼中提取出來(lái)的天然高分子多糖，殼聚糖作為天然陽(yáng)離子多糖，分子鏈上氨基質(zhì)子化后易黏附并跨越表面負(fù)電的疏水性細(xì)胞膜， 已被證明具有良好的生物相容性、生物可降解性和低/無(wú)毒性，因而CS是一種極具發(fā)展前景的基因載體材料。文獻(xiàn)HOWARDKA, RAH BEK UL, L IU X，et al. RNA in terference in vi tro and in vivo using a ch itosan/s iRNA n anopart icle system[J]. MolTher, 2006, 14(4) :476-484.報(bào)導(dǎo)，Howard等制備了 siRNA殼聚糖納米粒，在體外通過(guò)熒光顯微鏡觀察到在Ih內(nèi)siRNA殼聚糖納米粒被小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH 3T3細(xì)胞攝取， 人肺癌細(xì)胞H 1299和鼠腹膜巨噬細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，4h后由納米粒介導(dǎo)的基因沉默所引起的綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)分別減少77. 9%和90%，而市售轉(zhuǎn)染劑TransIT2TK0作用24h 才能達(dá)到類似效果。原因可能是小粒徑(18(T330nm)和多余的正電荷有利于納米粒與細(xì)胞膜的相互作用。鼻腔給藥試驗(yàn)表明，與錯(cuò)排siRNA的對(duì)照組和空白組相比，轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)支氣管上皮細(xì)胞EGFP表達(dá)分別降低37%和43%。目前siRNA的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)研究很多，但是大部分都是基于靜脈注射給藥的傳遞系統(tǒng)，不適用于鼻咽部位給藥。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種小分子干擾核糖核酸殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)及制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，滿足臨床應(yīng)用的需要。所述的小分子干擾核糖核酸殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，以殼聚糖為傳遞主體，以所述傳遞系統(tǒng)的總重量為基準(zhǔn)，含有O. 5^2. 0%的小分子干擾核糖核酸和10% 25%的多聚磷酸鈉；優(yōu)選的，所述的小分子干擾核糖核酸殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，以殼聚糖為傳遞主體，含有I. O I. 5%的小分子干擾核糖核酸和12% 18%的多聚磷酸鈉；優(yōu)選的，所述的小分子干擾核糖核酸殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，還包括載體，所述載體選自環(huán)糊精衍生物或海藻糖中的一種以上；其中環(huán)糊精衍生物具有促進(jìn)納米粒鼻粘膜吸收的作用，海藻糖具有凍干時(shí)保護(hù)納米粒作用；所述納米粒凍干前后粒徑為6(T200nm，Zeta電勢(shì)10 70mV ；優(yōu)選的，凍干前后粒徑為8(Tl50nm，Zeta電勢(shì)20 40mV。所述載體與殼聚糖、小分子干擾核糖核酸和多聚磷酸鈉總重量之比為載體總重量=20 100 : I ;優(yōu)選的為載體總重量=50 70 I ；優(yōu)選的，所述載體為環(huán)糊精衍生物和海藻糖的混合物，重量比為環(huán)糊精衍生物海藻糖=1 3. 5 I ；所述小分子干擾核糖核酸為無(wú)靶向功能基因(陰性)的小分子干擾核糖核酸、靶向 Bcl-2基因、survivin基因或其他鼻咽癌相關(guān)基因的小分子干擾核糖核酸(由百奧邁科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成);Bcl-2基因的相關(guān)信息，在p53，pl6，bcl-2, cox-2與鼻咽癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J] 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26 (10) 1849-1851.有詳細(xì)的報(bào)導(dǎo)，Bcl_2基因位于18號(hào)染色體上， 含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，為抗凋亡基因，編碼相對(duì)分子量為25X IOOOu的癌蛋白，其高表達(dá)能阻礙腫瘤細(xì)胞的凋亡，并可能和鼻咽癌的發(fā)生、演進(jìn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Bcl-2可在細(xì)胞周期的任一階段抑制細(xì)胞的凋亡，其生物學(xué)機(jī)制尚處于研究階段。Bcl-2基因可抑制多種細(xì)胞凋亡，在多種惡性腫瘤中均有表達(dá)，如肺癌、卵巢癌、鼻咽癌、子宮癌等。一些研究發(fā)現(xiàn)，bcl-2是一種廣義的抗凋亡基因，有抑制癌細(xì)胞凋亡，從而使癌細(xì)胞增殖和增殖細(xì)胞的存活，使細(xì)胞平衡失調(diào)導(dǎo)致各種腫瘤發(fā)生的作用。所述survivin基因在申請(qǐng)?zhí)枮镃N201110079879. X的中國(guó)專利中有詳細(xì)的報(bào)導(dǎo)， Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白成員之一，具有強(qiáng)大的抗細(xì)胞凋亡作用，并在維持細(xì)胞有絲分裂及血管形成調(diào)控過(guò)程中起重要作用，是致癌過(guò)程的重要因素。殼聚糖的黏均分子量為5 100萬(wàn)，脫乙酰度為80%以上。所述環(huán)糊精衍生物如羥丙基_ β _環(huán)糊精或任意甲基化_ β _環(huán)糊精等；所述的小分子干擾核糖核酸的納米粒傳遞系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟將siRNA的DEPC水溶液與多聚磷酸鈉的DEPC水溶液混合，滴加入ρΗ4 6殼聚糖的醋酸鈉緩沖液，速度為10 25滴/分鐘，然后靜置20 40min，收集siRNA的納米粒溶液，再與載體混合，濃縮至原體積的10 30%，-30 25°C程序凍干，獲得凍干物，即為所述的小分子干擾核糖核酸的納米粒傳遞系統(tǒng)，2 8°C保存，用前DEPC水復(fù)溶成所需濃度；凍干物與水的重量比例1:廣1:10 ;所述DEPC水，為經(jīng)焦碳酸二乙酯除核酸酶處理的水，簡(jiǎn)稱DEPC水；siRNA 的 DEPC 水溶液的濃度為 10 40 μ g/100 μ I ；多聚磷酸鈉的DEPC水溶液的濃度為I 2mg/ml ；殼聚糖的醋酸鈉緩沖液中，殼聚糖的濃度為I 2mg/ml ；體積比為siRNA的DEPC水溶液多聚磷酸鈉的EDPC水溶液殼聚糖的醋酸鈉緩沖液= I I 4 5 20 ;本專利技術(shù)基于鼻咽部獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)和生理特點(diǎn)，研制了鼻腔局部治療鼻咽癌的 siRNA的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)。本專利技術(shù)能有效的將siRNA遞送進(jìn)入鼻咽癌組織，靶向性好，給藥劑量小，可避免siRNA注射給藥后，在到達(dá)鼻咽部之前的降解和其他組織的攝取。 CS納米粒可有效保護(hù)siRNA不被鼻腔液破壞。本專利技術(shù)的siRNA傳遞系統(tǒng)，可在鼻咽癌細(xì)胞中有效抑制相關(guān)基因。附圖說(shuō)明圖I為本專利技術(shù)例I的納米粒粒徑電位分布圖。圖2為瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖3為本專利技術(shù)實(shí)施例3的納米粒對(duì)鼻本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，其特征在于，以殼聚糖為傳遞主體，以所述傳遞系統(tǒng)的總重量為基準(zhǔn)，含有0.5~2.0%的小分子干擾核糖核酸和10%～25%的多聚磷酸鈉，所述納米粒凍干前后粒徑為60~200nm，Zeta電勢(shì)10～70mV。
【技術(shù)特征摘要】
1.小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，其特征在于，以殼聚糖為傳遞主體， 以所述傳遞系統(tǒng)的總重量為基準(zhǔn)，含有O. 5^2. 0%的小分子干擾核糖核酸和10% 25%的多聚磷酸鈉，所述納米粒凍干前后粒徑為60 200nm, Zeta電勢(shì)10 70mV。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，其特征在于，含有I. O I. 5%的小分子干擾核糖核酸和12% 18%的多聚磷酸鈉，凍干前后粒徑為 80 150nm，Zeta 電勢(shì) 20 40mV。3.小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，其特征在于，以殼聚糖為傳遞主體， 以所述傳遞系統(tǒng)的總重量為基準(zhǔn)，含有O. 5^2. 0%的小分子干擾核糖核酸和10% 25%的多聚磷酸鈉以及載體，所述載體選自環(huán)糊精衍生物或海藻糖中的一種以上，所述載體與殼聚糖、小分子干擾核糖核酸和多聚磷酸鈉總重量之比為載體總重量=20 100 : I ；所述納米粒凍干前后粒徑為6(T200nm，Zeta電勢(shì)10 70mV。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，其特征在于，含有I. O I. 5%的小分子干擾核糖核酸和12% 18%的多聚磷酸鈉以及載體，所述載體選自環(huán)糊精衍生物或海藻糖中的一種以上，所述載體與殼聚糖、小分子干擾核糖核酸和多聚磷酸鈉總重量之比為載體總重量=50 70 : I ;凍干前后粒徑為8(Tl50nm, Zeta 電勢(shì)20 40mVo5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，其特征在于，所述載體為環(huán)糊精衍生物和海藻糖的混合物，重量比為環(huán)糊精衍生物海藻...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳聞?wù)?/a>，侯惠民，姚孝林，謝佳雯，徐曉寒，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海現(xiàn)代藥物制劑工程研究中心有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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