篩選促進皮膚屏障功能恢復的物質的方法技術

本發明專利技術提供了篩選促進皮膚屏障功能恢復的物質的方法，該方法包括：在存在促進皮膚屏障功能恢復的物質的候選物的情況下，孵育胱天蛋白酶-14和鞘脂激活蛋白原的步驟，和與對照物質相比，顯著促進鞘脂激活蛋白原分解為鞘脂激活蛋白A時，選擇該候選化合物為促進皮膚屏障功能恢復的物質的步驟。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及以胱天蛋白酶(caspase)-14對鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的分解為指標，。
技術介紹
角質細胞由于終末分化，對有害環境形成被稱為“角質層”的保護屏障、角質層細胞間隙的脂類在該保護屏障中發揮重要的作用。角質層細胞間隙的脂類，在表皮角質細胞中與分化同時生物合成，積累在角質小體中。角質 層細胞間隙的脂類的主要成分神經鞘胺醇，是通過葡糖腦苷脂酶切斷由角質小體的胞吐作用釋放到角質層細胞間隙中的葡糖神經鞘胺醇的糖鏈而生成的。此外，已知在其他途徑中，由鞘磷脂酶將鞘髓磷脂分解為神經鞘胺醇。作為鞘脂類活化蛋白質的鞘脂激活蛋白(saposin)是水解鞘脂類必需的蛋白質，已知存在4種鞘脂激活蛋白(鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C、鞘脂激活蛋白D)。由于鞘脂激活蛋白是作為產生角質層細胞間隙脂類必需的神經鞘胺醇合成酶(例如葡糖腦苷脂酶、鞘磷脂酶等)的輔酶作用的因子，所以認為鞘脂激活蛋白對皮膚屏障功能而言是重要的。迄今為止，已確認鞘脂激活蛋白A、C、D如果在內臟中積累，則產生溶酶體忙積癥(例如，Gaucher氏病、Niemann-Pick病)，鞘脂激活蛋白原(prosaposin)基因的突變造成神經損傷性的表型。已報道了在患有與皮膚相關的特應性皮炎或牛皮癬的患者中，鞘脂激活蛋白原降低(分別參見Tezuka等人，Journal of InvestigativeDermatology(1997) 109, 319-323 和 Alessandrini 等人，Journal of InvestigativeDermatology(2001) 116, 394-400)。已知在各種皮膚疾病(例如特應性皮炎、牛皮癬、接觸性皮炎等)中可見的皮膚粗糙癥狀中，水分從皮膚的喪失比健康皮膚更旺盛。所謂的水分透皮蒸發量(TEWL)的增加可以認為與承擔保持皮膚內的水分或作為屏障功能的成分減少相關。迄今為止，已報道了伴隨著皮膚屏障功能降低，皮膚的皮膚功能降低，其結果是出現皮膚增殖性異常的情況。特別是在高齡對象的情況下，由于恢復已降低的皮膚屏障功能花費長的時間，因而需要新型皮膚屏障功能恢復劑，所述新型皮膚屏障功能恢復劑對于阻止隨年齡增加而導致皮膚的皮膚功能降低所造成的皮膚增殖性異常等有效。對所研究的包括促進皮膚屏障功能恢復的制劑等化妝品在內的物質，必須在動物實驗中確認其效果。然而，近年來，在化妝品研發的實際情況中，具有出于倫理的觀點限制動物實驗的傾向，對不用動物而篩選候選物質的方法需求變高。現有技術文獻非專利文獻非專利文獻l:Tezuka 等人，Journal of InvestigativeDermatology(1997) 109, 319-323非專利文獻2 Alessandrini 等人，Journal of InvestigativeDermatology(2001) 116, 394-400
技術實現思路
專利技術要解決的課題本專利技術的課題是提供使用新型指標的恢復皮膚屏障功能的物質的篩選方法。解決課題的手段胱天蛋白酶(caspase) -14是胱天蛋白酶(caspase)家族的最新成員，主要在分化的角質細胞中表達。胱天蛋白酶-14鑒定出了胱天 蛋白酶家族成員間相同的EST。根據最近的研究顯示，角質化細胞中的胱天蛋白酶-14加工變成異二聚體，之后表現出對與胱天蛋酶-I對應的合成底物Trp-Glu-His-Asp-AFC的酶的活性(MikolajczykJ.等人，Biochemistry 43，10560-9 (2004))。這一水解活性對蛋白質分解切割和親液鹽的存在是必需的。胱天蛋白酶-14的一級結構與炎性胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶(caspase) -I、_4和-5)非常相似，但胱天蛋白酶(caspase) -14僅限于分化的角質細胞中表達，提示與角質細胞終末分化中的其他形態相關(Lippens S.等人，Cell DeathDiffer. 7，1218-24(2000))。然而，尚未了解胱天蛋白酶_14的活化機制、天然底物或調節因子。在本文中，本專利技術人從分化的培養人表皮角質化細胞(NHEK )提取物中分離與胱天蛋白酶-14結合的蛋白質，進行LC/MS/MS分析，從結合胱天蛋白酶-14的蛋白質中鑒別出鞘脂激活蛋白原(prosaposin)。本專利技術人發現了鞘脂激活蛋白原在從基底層至顆粒層中表達，而鞘脂激活蛋白A在顆粒層最上層部分中表達，此外，胱天蛋白酶-14參與鞘脂激活蛋白原的加工，產生鞘脂激活蛋白的中間體和鞘脂激活蛋白A，從而完成了本專利技術。因而，本申請包括以下專利技術(I)，該方法包括在存在促進皮膚屏障功能恢復的物質的候選物的情況下，孵育胱天蛋白酶(caspase)-14和鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的步驟,和與對照物質相比，顯著促進鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解為鞘脂激活蛋白(saposin) A時，選擇該候選化合物為促進皮膚屏障功能恢復的物質的步驟。(2)在(I)中記載的方法,通過使用抗鞘脂激活蛋白(saposin) A抗體的蛋白質印跡方法評估上述分解。專利技術的效果一直以來，已知在體外實驗中，胱天蛋白酶-14僅在存在高濃度的親液鹽(例如檸檬酸)的條件下表現出活化作用。因此，一直不清楚胱天蛋白酶-14在體內實現的功能。此次，本專利技術人首次明確了在不添加親液鹽的條件下胱天蛋白酶-14限定分解鞘脂激活蛋白原，產生鞘脂激活蛋白的中間體和鞘脂激活蛋白A(圖I)。本專利技術人通過免疫染色進一步明確了鞘脂激活蛋白原(prosaposin)在從基底層至顆粒層中表達，此外，鞘脂激活蛋白A存在于皮膚的顆粒層上部(圖2)。根據以上結果，認為胱天蛋白酶-14在生物體內有利于鞘脂激活蛋白原的加工。鞘脂激活蛋白原的分解產物鞘脂激活蛋白作為生成角質層間隙的脂類所必需的神經鞘胺醇合成酶的輔助因子發揮作用，是形成表皮屏障所必需的，根據本專利技術的方法，以胱天蛋白酶-14分解成鞘脂激活蛋白A為指標，可以不進行動物實驗，而研究新型的促進皮膚屏障功能恢復的物質。附圖說明圖I :在存在或不存在胱天蛋白酶(caspase) -14的條件下，顯示鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的加工的示意圖。圖2 :顯示人正常皮膚中的鞘脂激活蛋白原(prosaposin)和鞘脂激活蛋白A的局部分布的免疫染色圖。具體實施方式 本專利技術提供了，該方法包括在存在促進皮膚屏障功能恢復的物質的候選物的情況下，孵育胱天蛋白酶(caspase)-14和鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的步驟，和與對照物質相比，顯著促進鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解為鞘脂激活蛋白(saposin) A時,選擇該候選化合物為促進皮膚屏障功能恢復的物質的步驟。本專利技術方法中使用的候選物沒有限制，可以考慮例如活化胱天蛋白酶(caspase) -14,由此促進鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解的物質。胱天蛋白酶-14是半胱氨酸蛋白酶，因此，還原劑或具有還原作用的物質，例如巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)等試劑、谷胱甘肽等生物體內的物質、具有還原作用的植物提取液可以成為該候選物。在存在該候選物的條件下，孵育胱天蛋白酶-14和鞘脂激活蛋白原，當與對照相比顯著促進鞘脂激本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：日比野利彥，山本真實，
申請(專利權)人：株式會社資生堂，
類型：
國別省市：