本發明專利技術涉及用O-磷酸絲氨酸作為中間體生產半胱氨酸或其衍生物的方法以及用于生產O-磷酸絲氨酸的重組微生物。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及用O-磷酸絲氨酸作為中間體生產胱氨酸或其衍生物的方法以及用于生產O-磷酸絲氨酸的重組微生物。
技術介紹
L-半胱氨酸是在所有生物體的硫代謝中起著重要作用的氨基酸。它用于生物合成蛋白質，如毛發角蛋白、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸和其它含硫代謝物以及作為輔酶A的前體。此外，半胱氨酸的生物合成已知與其它氨基酸的生物合成密切相關，包括L-絲氨酸、L-甘氨酸和L-蛋氨酸。工業上，發現L-半胱氨酸及其衍生物應用于各種領域，包括制藥業(用于治療支氣管疾病)、化妝品工業(在洗發液中、用于燙發的組合物)和食品工業(抗氧化劑、增味劑、面團助劑(dough aids)等)。L-半胱氨酸曾通過將人頭發或動物羽毛進行酸水解工業性地獲得(氨基酸生產的生物技術(Biotechnology of the Amino Acids Production) Ko Aida 編,p 217-223,1986)。然而，不僅從頭發或羽毛獲得的半胱氨酸的產量低至7 8%，而且鹽酸或硫酸的使用產生大量的廢水，引起環境污染。此外，從頭發或羽毛中進行提取可誘發使用者對其強烈的厭惡感。這些問題導致迫切需要開發環境友好型L-半胱氨酸的生產方法。現代主要途徑包含用微生物發酵。在微生物生產L-半胱氨酸中，代表性的為I)用微生物對D、L-ATC進行生物轉化(Ryu 0H,Ju JY和 Shin CS, Process Biochem.，32 :201_209，1997)。然而，由于前體D、L_ATC的低溶解度，這種轉化方法在難以工業上應用。2)另一種生產L-半胱氨酸的方法為用大腸桿菌直接發酵(專利號EP0885962B ；ffada M和 Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem. ,73 48-54,2006)。微生物體內的L-半胱氨酸的過度積累導致細胞內毒性，限制了 L-半胱氨酸的高濃度生產。為了克服這種缺陷，使用了 L-半胱氨酸-輸出蛋白，但在生產率上也沒有顯著的改善。至于微生物和植物體內的L-半胱氨酸的生物合成途徑，O-乙酰基-絲氨酸(OAS)作為一種中間前體物，提供L-半胱氨酸的碳骨架(Kredich匪和Tomkins GM, J. Biol.Chem. ,241 =4955-4965,1966)。O-乙酰基絲氨酸巰解酶(OASS)，用硫化氫作為硫供體，催化乙酰基絲氨酸向半胱氨酸的轉化。或者，在半胱氨酸的生產中，可將SO4還原成硫代硫酸鹽作為硫供體(Nakamura T, Kon Y, Iwahashi H 和 Eguchi Y, J. Bacteriol. , 156 :656-662,1983)。因此，可用各種硫供體，用微生物積累OAS和OASS生產半胱氨酸(US6，579，705)。通過OAS的半胱氨酸生物合成途徑使用兩種酶，絲氨酸乙酰轉移酶(CysE)催化絲氨酸向OAS的轉化,半胱氨酸合成酶(CysK)催化OAS向半胱氨酸的轉化。這其中，絲氨酸乙酰基轉移酶(CysE)對最終產物半胱氨酸的反饋抑制作用高度敏感(Wada M and Takagi H，Appl.Microbiol. Biochem.，73 :48-54,2006)。
技術實現思路
技術問題本專利技術的專利技術人通過深入研究完成本專利技術，發現在超嗜熱古菌(Aeropyrumpernix)、結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)中存在用于合成L-半胱氨酸的O-磷酸絲氨酸巰解酶(OPSS),其采用O-磷-L-絲氨酸(OPS)-特異性途徑，而非OAS-特異性途徑(Mino K和Ishikawa K，FEBSletters,551 :133-138,2003 ；Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLaffertyFW 和 Begley TP，J.Am. Chem. Soc.，127 :11602-11603，2005 ；ffestrop ⑶，Goodall G,Mottram JC and Coombs GH,J. Biol. Chem. ,281 :25062-25075, 2006)，以及當結核分支桿菌的OPSS的5個C-末端氨基酸殘基被去除后，即使不存在額外的酶，其也可利用Na2S作為硫供體，將 OPS 轉化成半胱氨酸(Argen D, Schnell R 和 Schneider G, FEBS letters, 583 330-336，2009)。本專利技術中，將微生物進行突變，從而在其體內積累OPS，接下來用OPSS酶進行孵育，從而將OPS轉化成半胱氨酸。該方法之前在任何地方都沒有公開過。技術方案本專利技術的一個目的在于提供生產半胱氨酸或其衍生物的方法。本專利技術的另一個目的在于提供用于生產O-磷酸絲氨酸的重組微生物。有益效果本專利技術的方法通過重組微生物高產量地生產O-磷酸絲氨酸并將其轉化成半胱氨酸，事實上，這更加環保，并且確保比化學合成方法更高效地生產半胱氨酸。本專利技術通過發酵和生物轉化而生產的半胱氨酸及其衍生物可廣泛應用于生產動物和人類食品和食品添加劑。附圖說明圖I為通過微生物發酵積累O-磷酸絲氨酸和積累的O-磷酸絲氨酸酶轉化成L-半胱氨酸的示意圖。圖2所示為根據溫度的OPS巰解酶的活性。圖3為一組表示OPS巰解酶pH敏感性的圖表。圖4所示為通過SDS-PAGE分析的pET系統和pCL_Pc j I系統中Msm-T表達水平的照片。圖5所示為將純化的OPS發酵培養液(fermentation broth)轉化成半胱氨酸的OPS巰解酶的酶活性的圖。圖6所示為將OPS發酵培養液轉化成半胱氨酸的OPS巰解酶的酶活性的圖。具體實施例方式如本申請中所使用的，術語“半胱氨酸轉化”是指O-磷酸絲氨酸巰解酶(OPSS)的催化反應，其引起底物O-磷酸絲氨酸(OPS)轉化成產物半胱氨酸，即，它是指將OPS轉化成半胱氨酸的催化反應。如本申請中所使用的，術語“半胱氨酸轉化率”是指產物半胱氨酸的量和起始原料OPS的百分比。在最佳的反應條件下，I摩爾OPS被轉化成I摩爾半胱氨酸。例如，如果100摩爾的OPS被轉化成100摩爾的半胱氨酸，那么半胱氨酸轉化率為100%。根據其一個方面，本專利技術提供生產半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括I)培養經過修飾降低了內源磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)活性的重組微生物，以生產O-磷酸絲氨酸(OPS)；以及2)0-磷酸絲氨酸巰解酶(OPSS)或表達OPSS的微生物存在下，將步驟I)的OPS和硫化物進行反應，以生產半胱氨酸或其衍生物。該方法中，步驟I)與培養內源磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)活性降低的重組微生物有關。SerB是具有將OPS水解成L-絲氨酸的活性的蛋白質。因此，內源SerB活性降低的重組微生物的特征在于其積累OPS。SerB可包括但不限于任何表現SerB活性的氨基酸序列，并且優選可具有SEQ ID NO :1或2所示的氨基酸序列。然而，只要表現出SerB活性，可使用任意氨基酸序列，優選與SEQ ID NO :1或2具有90%或以上，更優選96%或以上，還更優選98%或以上，最優選99%或以上的同源性。降低的S本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：申秀安，嚴惠媛，張真淑，裵賢愛，全成后，趙宰賢，宋秉哲，李京珉，梁殷彬，申容旭，金蕙園，金率，
申請(專利權)人：CJ第一制糖株式會社，
類型：
國別省市：
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