一種萘醌類化合物紫草素，其作為葡萄糖醛酸轉移酶UGT1A9和UGT1A8的特異性探針底物，可用于UGT1A9/1A8酶活的定量測定。具體操作流程如下：選擇紫草素作為特異性探針底物，并借助UGT體外孵育體系開展特異性底物的UGT催化反應，通過定量檢測單位時間內的底物消除量或其產物生成量來測定各生物樣品及細胞中UGT1A9和UGT1A8酶的活性。本發明專利技術可用于不同種屬、不同個體、不同來源生物樣本中UGT1A9/1A8酶活的定量評估，并可用于標定特定組織代謝麻醉藥物異丙酚的能力，以及基于體外代謝動力學數據標定和預估UGT1A9代謝為主的化合物在特定機體的代謝清除率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于醫藥
，具體涉及一種UGT1A9/1A8的特異性探針底物及其應用。
技術介紹
UGT (尿苷二憐酸葡萄糖醒酸轉移酶，Uridine diphosphate-glucuronosyltransferase)酶家族是人體內重要的代謝酶系，其負責清除多種內源性化合物如膽紅素，5-羥色胺，甲狀腺素等以及大量外源性化合物如伊利替康，雷洛昔酚，對乙酰氨基酚等藥物，以及己烯雌酚、雙酚A等食品及環境毒物等(Drug MetabolismDisposition. 2004，32:1201-1208)。UGT酶中的I家族和2家族是UGT酶系的兩個主要家族，其中 UGTl 家族共有 9 個亞型1A1,1A3, 1A4, 1A5, 1A6，1A7，1A8，1A9 和 IAlO0 UGTlA 的 9·個亞型在人體的組織分布上具有明顯的組織特異性。其中UGT1A1，1A3, 1A4，1A6，1A9在肝臟中都有豐富的表達(1A6和1A9在腎臟中的表達要比肝臟還高)，而1A4，1A6和1A9在腸道中幾乎不表達。UGT1A7主要在食道和氣管和宮頸等組織分布，UGT1A8和1A10主要在小腸和結腸中表達豐富，肝臟中不表達。UGT酶活性的體外評價體系主要包括重組單酶、哺乳動物的亞細胞組分、新鮮提取的肝細胞、原代培養肝細胞、肝切片、肝灌流等(Toxicology in Vitro2006, 135-153),其中已經商品化的人重組UGT單酶主要來自于細菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞以及酵母菌建立的克隆表達體系，而亞細胞組分主要包括微粒體、S9成分。采用這些標準化的評價體系，結合相應的輔因子(如=UDPGA等)和孵育條件，可通過檢測探針底物的代謝清除或產物生成速率，對上述各種體系中表達的UGT酶活性進行表征。UGTlA中的多個亞型在氨基酸序列上具有很高的同源性，因而催化的底物具有廣泛的交叉性，目前UGT各個亞型的特異性探針底物很缺乏。UGT1A9在氨基酸序列上與1A7，I AS, 1A10亞型之間具有高度同源性(>93%)，因而這些酶之間經常顯示具有共底物的代謝特征。由于UGT1A9亞型主要分布于肝臟和腎臟,而1A8,1A10主要在腸中表達同時不在肝臟組織中表達(Plos One. 2007. e396)。所以在體外以組織微粒體和S9為主的代謝體系中，盡管一個化合物是UGT1A8和UGT1A9的共底物，但由于這兩種酶在人體的組織分布特異性也可將UGT1A9和UGT1A8對該化合物在肝臟和腸道的代謝能力解析清楚，同時該化合物若不被其它UGT酶代謝其不僅可作為肝臟中UGT1A9的特異性探針底物，又可作為腸道UGT1A8的特異性探針底物。UGT1A9主要負責代謝清除一些非留體類抗炎藥物如對乙酰氨基酚，吲哚美辛等，治療帕金森癥的輔助藥物伊托卡朋和一些天然產物如黃酮，蒽醌，香豆素類化合物等，而UGT1A8主要負責代謝如藥物雷洛昔酚，嗎啡，天然的黃酮等。對這兩個酶的代謝活性的評估具有十分重要的意義。綜上所述，UGT酶的特異性探針底物的篩選及開發意義重大。目前麻醉藥物異丙酚就是UGT1A9代謝為主的藥物(其可被UGT1A9、1A7和1A8催化生成其單葡萄糖醛酸化產物)，已在臨床上廣泛使用。本專利技術中紫草素具有代謝產物單一(僅生成一個單葡萄糖醛酸化產物)、代謝酶高選擇性(肝臟僅UGT1A9代謝、腸中僅UGT1A8參與其代謝)、代謝速率快、代謝產物易檢測等特點。此外，紫草素作為我國和澳大利亞等國家的合法食品添加劑，其具有高安全性(小鼠口服LD5tl為2700-7990mg/kg)，因此其作為體內UGT1A9的探針要比麻醉藥物異丙酚更加安全。而腸道主要代謝酶UGT1A8—直未有特異性探針底物的報道，本專利技術的提出將填補該領域的空白。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種萘醌類化合物紫草素及其應用，該紫草素可作為UGT1A9和UGT1A8的高特異性體外探針底物，用于定量測定不同來源生物樣本中UGT1A9及UGT1A8的酶活。由于目前尚未見文獻報道UGT1A8的特異性探針底物，紫草素作為探針底物能夠特異性的評價機體或組織中UGT1A9酶和UGT1A8酶對藥物的處置能力，對藥物代謝相關基礎研究具有重要意義。此外，紫草素作為肝臟UGT1A9的探針底物，與異丙酚相比更具優勢。本專利技術提供了一種萘醌類化合物紫草素，該紫草素的名稱為5，8_ 二羥·基-2-(1-羥基-4-甲基-3-戊烯基)-I, 4-萘醌，其是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A9和1A8的特異性探針底物，其結構如圖I所示。本專利技術還提供了所述紫草素定量測定生物體系中UGT1A8或UGT1A9酶活的方法，采用紫草素作為探針底物，通過定量檢測單位時間內的底物的消除量或其O-葡萄糖醛酸化產物的生成量來測定各生物樣品及細胞中UGT1A9或1A8酶的活性；其測定方法為—體系中以紫草素作為特異性探針底物；底物濃度選擇1/5 5Km之間；——在具有輔因子UDPGA的孵育體系中，反應溫度為10°C至60°C之間；—反應時間為5-120分鐘，在確保以上底物相應的葡萄糖醛酸化代謝產物紫草素單葡萄糖醛酸化產物(5，8- 二羥基-2-(1-0葡萄糖醛酸-4-甲基-3-戊烯基)-I，4-萘醌)達到定量限且底物轉化率低于10%時終止反應；測定單位時間內底物減少量或單葡萄糖醛酸化產物生成量作為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸1A9和1A8酶活性的評價指標。其中檢測底物減少量或其對葡萄糖醛酸化產物生成量的定量檢測方法為采用陣列二極管檢測器最大吸收波長為517nm，質譜、放射性同位素示蹤技術等也可用于檢測紫草素及其葡萄糖醛酸化產物。所用的檢測器可以用其中的一種或多種串聯。本專利技術提供的紫草素用于標定特定組織代謝麻醉藥物異丙酚的能力，以及標定和預估UGT1A9代謝為主的化合物在特定機體的代謝清除率。采用人類重組表達UGT1A9或1A8單酶，肝微粒體，腎微粒體或腸微粒體或相應的S9孵育體系進行考察，通過相關性分析，特異性抑制實驗，重組單酶代謝反應，以及酶反應動力學幾方面的證據，證明紫草素可高選擇性的被肝臟UGT1A9酶和腸道UGT1A8酶催化代謝并生成紫草素2- (1-0)-單葡萄糖醛酸化代謝產物(如圖3所示)UFLC圖譜見圖4，代謝產物的結構見圖4。作為UGT1A9和1A8的特異性探針底物，紫草素可用于檢測人重組UGT單酶中UGT1A9/1A8的活性，尤其適合用于對細菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞以及酵母菌克隆表達體系生產的UGT1A9和UGT1A8重組酶的酶活測定，以及多種哺乳動物組織器官來源的微粒體、S-9等制備物中UGT1A9和UGT1A8的活性標定。選用本專利技術所述紫草素作為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A9和1A8的特異性探針底物檢測酶的體外活性具有以下突出優勢(I)高選擇性紫草素可以被肝臟或腎臟中的UGT1A9特異性地代謝，也可以被腸道中的UGT1A8特異性代謝生成相應的單葡萄糖醛酸化產物。(2)易于獲得底物紫草素是中藥紫草中含有的天然化學成分，來源簡單易于分離純化，無需化學合成。(3)易于檢測，紫草素可以利用陣列二極管檢測器進行檢測，UV檢測器對其也有一定的吸收，這些檢測器相對容易獲得。異丙酚因為其分子結構簡單，沒有光譜吸收只能采用質本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種萘醌類化合物紫草素，化學名稱為5，8？二羥基？2？(1？羥基？4？甲基？3？戊烯基)？1,4？萘醌，其特征在于：該紫草素作為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A9和1A8的特異性探針底物，其結構如式（1）所示。式（1）FDA00002260212600011.jpg
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊凌，何桂元，葛廣波，寧靜，朱亮亮，夏楊柳，
申請(專利權)人：中國科學院大連化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：
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