一種人體液HSP70膠體金標檢測試紙條及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域的一種人體液HSP70膠體金標檢測試紙條及其制備方法，此試紙條包括設在固定板上依次相連的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水紙；在硝酸纖維素膜上設有三條檢測線和一條質(zhì)控線：在金標墊上設有金標抗體。金標抗體為顯色抗體，所述檢測線為捕捉抗體，顯色抗體與捕捉抗體為1對雙抗體夾心配對的鼠抗人HSP70單克隆抗體，質(zhì)控線為羊抗鼠IgG。本發(fā)明專利技術(shù)的人體液HSP70膠體金標檢測試紙條，特異性高，結(jié)果易觀察，靈敏度達到15ng／mL，15min內(nèi)就能判讀結(jié)果，具有良好的穩(wěn)定性和重復性，操作簡便，無需特殊儀器設備，適宜在現(xiàn)場檢測基層醫(yī)院和實驗研究推廣和應用。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于免疫學分析
，具體涉及一種人體液中HSP70膠體金標檢測試紙條及制備方法。
技術(shù)介紹
熱休克蛋白家族(HSPs)是一類高度保守的蛋白，熱休克蛋白70 (heat shockprotein 70, HSP70)是熱休克蛋白家族中的重要成員，其分為誘導型的組成型的。當機體受到外界環(huán)境中多種不良因素刺激時，誘導型的HSP70蛋白表達升高。HSP70蛋白對細胞損傷的修復、存活和維持正常的細胞功能是必需的。在環(huán)境刺激、病原菌感染、疾病引起細胞應激損傷中發(fā)揮分子伴侶作用，阻止蛋白聚集，促進損傷蛋白的重新折疊。在大多數(shù)的哺乳動物，只有在應激條件下誘導型HSP70表達，而且顯著的細胞和機體應激后才能檢測到，但是在人和靈長類，誘導型的HSP70有一個基準值，在一些特殊條件下如過熱、化學有毒物·質(zhì)暴露、缺氧、缺體、感染、自身免疫性疾病、凋亡、器官移植、細菌和病毒引起的感染，動脈粥樣硬化等心體管疾病中，生物體的HSP70表達顯著升高；在正常老化過程，精子發(fā)生，月經(jīng)，運動練習等正常生理過程中，生物體的HSP70表達也顯著升高，提示其在這些過程中可能發(fā)揮重要作用。酶聯(lián)免疫吸附分析(enzymelinked immμ nosorbent assay, ELISA)技術(shù)是目前進行體液生物蛋白檢測最為常用的方法，與其他檢測方法相比，ELISA檢測方法具有成本低、檢測設施設備簡單、快速高效的特點，并在不斷改進當中，已經(jīng)有直接ELISA、間接ELISA、單抗體ELISA，微波ELISA、雙抗體夾心ELISA方法。但是ELISA方法，目前只適用于實驗室檢測，不能適用于現(xiàn)場檢測。應激是機體在對生存環(huán)境中多種不利因素適應過程中，實際或認知上的要求與適應和應付能力之間不平衡導致的身心緊張狀態(tài)及其反應。應激同人的健康有密切聯(lián)系，這種聯(lián)系是雙向的一方面應激可影響人的健康，另一方面一個人的健康狀況也會影響應激條件下心理應激反應的強度和對應激的耐受力。適度的心理應激是人成長和發(fā)展的必要條件，適當?shù)膽び兄诰S持人的生理、心理和社會功能，應對挑戰(zhàn)既可以引起我們的緊張、勞累、苦惱和痛苦，又可以為我們帶來成功的喜悅、輕松和歡樂。但是長期、超過人適應和應對能力的應激就會損害人的健康，這是心理應激對健康的消極影響，主要表現(xiàn)在下述三個方面。首先，心理應激引起的心理和生理反應可以以癥狀和體征的形式見之于臨床，成為人們身體不適、虛弱和精神痛苦的根源和就醫(yī)需求幫助的原因；其次，心理應激可以加重已有的精神障礙和軀體疾病，或使這些疾病復發(fā)；最后，心理應激可以造成對疾病的易感狀態(tài)，并且在其他因素的共同作用下導致新的精神障礙和軀體疾病。隨著研究的深入，HSP70作為應激的生物標記物，可以檢測機體應激水平，預防應激損傷的發(fā)生，用于機體應激負荷健康風險評估。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是克服現(xiàn)有檢測HSP70技術(shù)的不足，提供一種人體液HSP70膠體金檢測試紙條。本專利技術(shù)的目的還在于提供上述檢測試紙條的制備方法。一種人體液HSP70膠體金標檢測試紙條，此試紙條由設在固定板I上依次相連的樣品墊2、金標墊3、硝酸纖維素膜4和吸水紙9組成；在硝酸纖維素膜4上設有第一檢測線5、第二檢測線6和第三檢測線7和一條質(zhì)控線8 ;在金標墊3上設有金標抗體。固定板I為具有壓敏膠的PVC板，樣品墊2為玻璃纖維膜，金標墊3為聚酯纖維膜。金標抗體為顯色抗體，檢測線為捕捉抗體，顯色抗體與捕捉抗體為I對雙抗體夾心配對的鼠抗人HSP70單克隆抗體。 金標抗體用粒徑為20nm-60nm的膠體金顆粒標記。質(zhì)控線8為羊抗鼠免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)。上述人體液HSP70膠體金標檢測試紙條的制備方法，包括以下步驟(I)用常規(guī)的檸檬酸三鈉還原法制備均勻粒徑為20nm-60nm的膠體金；(2)調(diào)節(jié)上述膠體金pH為8. 5-10，然后加入顯色抗體與其反應，其中顯色抗體的濃度為O. 04mg/ml，離心得沉淀，重懸沉淀，得金標抗體溶液，將金標抗體溶液用噴墨儀噴印在聚酯纖維膜，晾干；(3)將捕捉抗體用抗體稀釋液稀釋成濃度為lmg/ml的捕捉抗體溶液，用噴墨儀將捕捉抗體溶液在硝酸纖維素膜上噴劃三條平行檢測線，真空干燥；(4)將羊抗鼠IgG用抗體稀釋液稀釋成濃度為O. 5mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，用噴膜儀將抗體噴線在硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線，真空干燥；(5)按樣品墊、金標墊、硝酸纖維膜、吸水紙順序粘貼在固定板上，切條，裝入塑料袋，干燥包裝。離心的方法為反應液于5000xg離心30min，沉淀用lwt%牛血清白蛋白溶液重懸浮，反復2次；其中I wt %牛血清白蛋白溶液為IOmM的Tris-HCl緩沖溶液，pH為8. 5，含lwt%的牛血清白蛋白。步驟(2)中重懸沉淀的溶液為20mM的Tris-HCl緩沖溶液，pH為8. 5，其中含30wt%的海藻糖，lwt%的牛血清白蛋白，Iwt %的酪蛋白，體積濃度為O. 01%的Tween-20,O. 02 wt % 的 NaN3。抗體稀釋液為IOmM的磷酸鹽緩沖溶液，pH為7. 6，其中含10wt%的海藻糖，體積濃度為3%的甲醇。本專利技術(shù)的有益效果為用于人體液HSP70用于人體液HSP70檢測，檢測靈敏度高，準確性強、成本低，結(jié)果易觀察，靈敏度達到15ng/mL，15min內(nèi)能判讀結(jié)果，具有良好的穩(wěn)定性和重復性，操作簡便，無需特殊儀器設備，可用于機體應激水平的監(jiān)測，和其他疾病的輔助檢查，適宜在現(xiàn)場檢測基層醫(yī)院和實驗研究推廣和應用。附圖說明圖I為試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；其中各標號為I-為固定板，2-為樣品墊，3-為膠體金墊，4-為硝酸纖維素膜，5-第一檢測線，6-第二檢測線，7-第三檢測線，8-為質(zhì)控線，9-吸水紙。圖2為試紙條測試結(jié)果判定示意圖。圖3為HSP70單克隆抗體純化產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析圖。具體實施例方式下面將結(jié)合附圖和具體實例對本專利技術(shù)作進一步的說明。實施例I試紙條的制備和檢測以下述方式進行(I)膠體金顆粒制備將HAuCl4配制成濃度為O. Olwt%水溶液，取IOOml加熱至沸。攪動下準確加入2ml的lwt%檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7CH2O)水溶液。繼續(xù)加熱煮沸 15min。此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變?yōu)榛疑m(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。冷卻至室溫后用蒸餾水恢復至原體積。(2)膠體金質(zhì)量的分析采用多功能酶標儀對膠體金進行波長在400 800nm范圍光密度掃描，獲得其最大吸收波長和半峰寬。根據(jù)最大吸收波長判斷粒徑大小，根據(jù)半峰寬判斷粒徑均一程度。(3)顯色抗體金標記用K2CO3調(diào)整膠體金的pH值到8. 5,于IOOml金納米顆粒溶液中滴加顯色抗體4mg，攪拌5min，避光靜止放置30min，再加入25ml 5wt% BSA溶液(用IOmM的Tris-HCl緩沖溶液，pH為8. 5配制)，封閉2h以上，反應液5000xg離心30min，沉淀用125ml的lwt% BSA溶液(用IOmM的Tris-HCl緩沖溶液，pH為8. 5配制)重懸浮，反復處理2次，沉淀用Iml重懸液重懸沉淀，得到金標抗體。(4)金標墊的制備將金標抗體用噴膜儀噴印在聚脂纖維素膜上，干燥，用量最優(yōu)為 2 μ I /cm。(本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種人體液HSP70膠體金標檢測試紙條，其特征在于：此試紙條由設在固定板（1）上依次相連的樣品墊（2）、金標墊（3）、硝酸纖維素膜（4）和吸水紙（9）組成；在硝酸纖維素膜（4）上設有第一檢測線（5）、第二檢測線（6）和第三檢測線（7）和一條質(zhì)控線（8）；在金標墊（3）上設有金標抗體。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：錢令嘉，弓景波，王新興，戰(zhàn)銳，杲修杰，
申請(專利權(quán))人：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：