一條具有靶向卵巢癌特性的多肽制造技術(shù)

一條具有靶向卵巢癌特性的多肽，利用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)于卵巢癌腫瘤模型體內(nèi)篩選得到，其氨基酸序列為WSGPGVWGASVK。經(jīng)鑒定此多肽不僅可區(qū)分卵巢癌細(xì)胞和正常細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞和其他癌癥細(xì)胞進(jìn)而與卵巢癌細(xì)胞特異性結(jié)合，并且可有效地被卵巢癌細(xì)胞內(nèi)化，作為藥物載體可提高藥物的吸收率。此多肽在靜脈注射入腫瘤模型體內(nèi)后可有效地特異地富集于卵巢癌腫瘤區(qū)域，是一條全新的已證實(shí)其體內(nèi)靶向能力的多肽，可作為一種構(gòu)建靶向載體以傳遞抗癌藥物的理想配體。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于蛋白多肽
，涉及利用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)于卵巢癌腫瘤模型體內(nèi)篩選得到的一條具有靶向卵巢癌特性的多肽，包括多肽的氨基酸序列及相應(yīng)的核苷酸序列。
技術(shù)介紹
卵巢癌是一種常見的婦科腫瘤，發(fā)病率繼乳腺癌和子宮體癌位居第三，且惡性程度高，致死率僅次于乳腺癌，嚴(yán)重威脅著婦女的生命。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2011年全世界大約有225，500名婦女被診斷出患有卵巢癌，140，200名婦女死于此種疾病。長(zhǎng)期以來，切除手術(shù)、放療和化療的長(zhǎng)足進(jìn)步并未提高卵巢癌病人的存活率，因此急需發(fā)展更多的新技術(shù)解決這一難題。其中，藥物靶向傳遞理念的引入因可在最大化藥物抗癌效用的同時(shí)最小化對(duì)正常·器官的不良反應(yīng)，而成為最具價(jià)值和希望的腫瘤治療方法。而多肽因分子量小，組織穿透性好，無免疫原性且對(duì)細(xì)胞表面受體具有較高親和力而成為靶向傳遞研究中的理想配體。然而已知的天然受體-配體對(duì)是非常有限的。噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)的發(fā)展則為發(fā)現(xiàn)和表征新的配體及對(duì)應(yīng)受體提供了有力的工具，不僅有望實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用于腫瘤的靶向治療，也有助于解釋疾病發(fā)生機(jī)制的理論研究。嗤囷體展不技術(shù)通過將特定片段插入嗤囷體DNA中而將相應(yīng)的多妝表達(dá)在P III衣殼蛋白上，從而在噬菌體的DNA和衣殼蛋白之間搭建橋梁，使得各種靶分子的多肽配體可通過體外或體內(nèi)篩選得以快速鑒定。發(fā)展至今，應(yīng)用此技術(shù)已成功篩選得到針對(duì)肝癌、前列腺癌、乳腺癌等多種人類腫瘤的靶向多肽，但是對(duì)于篩選卵巢癌靶向配體的相關(guān)報(bào)道則很少。目前僅有Renata Pasqualini和Wadih Arap小組應(yīng)用此技術(shù)針對(duì)病人腹水(Oncogene, 2004(23)=8859-8867)和卵巢癌細(xì)胞(Cancer Res, 2006 (I) :34-40)體外篩選得到了可靶向結(jié)合卵巢癌的多肽，但是以上研究均側(cè)重體外細(xì)胞或蛋白層面上的研究，并未評(píng)價(jià)得到多肽的體內(nèi)靶向特性和作為配體應(yīng)用于傳遞藥物的能力。因此，本專利技術(shù)利用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)于卵巢癌腫瘤模型體內(nèi)篩選得到一條可靶向卵巢癌的十二肽，并對(duì)此多肽的體內(nèi)和體外靶向特性進(jìn)行了鑒定，以考察其作為靶向配體用于傳遞藥物至卵巢腫瘤部位的可行性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一條利用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)于卵巢癌腫瘤模型體內(nèi)篩選得到的具有靶向卵巢癌特性的多肽。本專利技術(shù)的目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn) 首先，將噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫(kù)注射入卵巢癌腫瘤模型體內(nèi)循環(huán)15分鐘，心臟灌流后回收腫瘤組織中的噬菌體進(jìn)行滴度測(cè)定和擴(kuò)增，擴(kuò)增后的噬菌體投入下一輪的篩選。上述的三輪體內(nèi)篩選后，分別于第二輪和第三輪篩選結(jié)果中隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行DNA的提取和測(cè)序。應(yīng)用生物信息學(xué)工具分析篩選得到的多肽序列，同時(shí)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)用于分析候選噬菌體單克隆對(duì)細(xì)胞的結(jié)合能力。挑選富集度高且對(duì)細(xì)胞選擇性結(jié)合力強(qiáng)的噬菌體克隆進(jìn)一步進(jìn)行體外直接的細(xì)胞結(jié)合內(nèi)化實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)回輸實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步利用免疫熒光術(shù)考察合成多肽與不同細(xì)胞的結(jié)合情況。本專利技術(shù)篩選得到的多肽經(jīng)鑒定具有以下特性及優(yōu)點(diǎn) (O多肽的氨基酸序列為WSGPGVWGASVK，未發(fā)現(xiàn)與此多肽序列完全一致的已知蛋白質(zhì)，是一條全新的多肽； (2)多肽在注入卵巢癌腫瘤模型后可指導(dǎo)其噬菌體載體有選擇性地富集于卵巢癌腫瘤區(qū)域，并顯著減少在肝臟和脾臟的富集，表現(xiàn)出針對(duì)卵巢癌具有良好的體內(nèi)靶向特性，具備靶向傳遞藥物或基因至卵巢癌病灶區(qū)域的能力； (3)多肽可有效地識(shí)別并特異性結(jié)合卵巢癌細(xì)胞系SK0V-3、A2780而對(duì)正常細(xì)胞系3T3、HUVEC，及其他腫瘤細(xì)胞A549、Hela, MG63的結(jié)合能力弱，表現(xiàn)出針對(duì)卵巢癌精準(zhǔn)的識(shí)別和結(jié)合能力； (4)多肽能通過結(jié)合的細(xì)胞表面受體介導(dǎo)有效地進(jìn)入細(xì)胞，有助于對(duì)藥物及基因于細(xì)胞內(nèi)的傳遞。(5)具有多肽分子量小，組織穿透性好，無免疫原性且對(duì)細(xì)胞表面受體具有較高親和力的普遍特點(diǎn)，結(jié)合該多肽對(duì)卵巢癌體內(nèi)體外良好的靶向能力，是一種卵巢癌的靶向傳遞系統(tǒng)。附圖說明圖I是7個(gè)噬菌體單克隆與細(xì)胞親和力的ELISA鑒定(噬菌體的相對(duì)結(jié)合力=OD待測(cè)!《菌體克隆/OD空白對(duì)照I 菌體)； 圖2是噬菌體克隆的腫瘤模型體內(nèi)回輸靶向鑒定(噬菌體的相對(duì)結(jié)合力=TUit3psw^g/TU空白對(duì)照I 菌體)； 圖3是體內(nèi)回輸中噬菌體克隆在組織中的分布； 圖4是噬菌體克隆與人組織切片結(jié)合能力鑒定； 圖5是噬菌體克隆對(duì)不同細(xì)胞的體外靶向能力鑒定(噬菌體的相對(duì)結(jié)合力=TUit3pswfei隆/TU空白對(duì)照I 菌體)； 圖6是多肽的免疫熒光檢測(cè)。具體實(shí)施例方式本專利技術(shù)通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步說明，但不作為本專利技術(shù)的限制。實(shí)施例 (I)噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫(kù)的體內(nèi)篩選及噬菌體單克隆DNA的測(cè)序及分析選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，于其右前肢腋下接種人卵巢上皮癌細(xì)胞SK0V-3以建立人卵巢癌腫瘤模型。選用New England Biolabs公司的Ph. D_12 肽庫(kù),PBS稀釋后注入腫瘤模型體內(nèi)循環(huán)15分鐘。心臟灌流后回收腫瘤組織進(jìn)行勻漿、稱重并裂解細(xì)胞回收其中的曬菌體，擴(kuò)增后投入下一輪體內(nèi)篩選。同時(shí)用New England Biolabs公司實(shí)驗(yàn)指南中所述方法測(cè)定每輪篩選中回收的噬菌體的滴度，提取于第二、三輪篩選結(jié)果中隨機(jī)挑取且擴(kuò)增的噬菌體單克隆DNA，送予上海生物生工公司進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)得的序列用DNAMAN軟件進(jìn)行翻譯，進(jìn)一步利用比對(duì)工具BLAST將多肽序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果I 經(jīng)過三輪的體內(nèi)篩選，噬菌體在第三輪于腫瘤中的富集顯著增加，是第一輪富集量的45倍。 隨機(jī)挑選第二、三輪噬菌體單克隆進(jìn)行DNA測(cè)序分析衣殼蛋白上所展示的多肽序列。其中，展示有WSGPGVWGASVK多肽序列的噬菌體單克隆PC2-1在第二輪中出現(xiàn)頻率為9.7%，而展示有同一多肽的PC3-1在第三輪的出現(xiàn)頻率上升至90. 7%，可見此噬菌體多肽經(jīng)過第三輪篩選在卵巢癌部位得到了有效富集，也反映了展示有WSGPGVWGASVK多肽的噬菌體單克隆(PC3-1/PC2-1)對(duì)卵巢癌表現(xiàn)有很強(qiáng)的親和力。BLAST比對(duì)分析結(jié)果顯示在已知數(shù)據(jù)庫(kù)中并未有與WSGPGVWGASVK多肽序列完全一致的蛋白質(zhì)，說明此12肽是全新的序列。(2)噬菌體單克隆的體內(nèi)回輸靶向鑒定 將擴(kuò)增后的噬菌體單克隆PC3-l、PC3-2和M13KE空白噬菌體用PBS稀釋后注入卵巢癌腫瘤模型中循環(huán)15分鐘，心臟灌流后回收腫瘤組織及其正常器官組織，將其一部分通過勻漿、稱重并裂解回收其中的噬菌體進(jìn)行滴度測(cè)定；另一部分通過固定、切片后利用HRP/抗M13噬菌體抗體進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。結(jié)果2 經(jīng)過體內(nèi)回輸后，PC3-1相較于空白噬菌體在卵巢癌腫瘤部位獲得了 39倍的富集，同時(shí)在肝臟和脾臟的富集相較于空白噬菌體分別減少了 76%和81%，這兩方面均反映了噬菌體克隆PC3-1在血液循環(huán)中對(duì)腫瘤組織的靶向能力(見附圖2)。而對(duì)照PC3-2則未顯現(xiàn)此種靶向能力。組織經(jīng)切片并免疫組化后，可見PC3-1于卵巢癌腫瘤切片上陽(yáng)性染色明顯，而僅有少量的空白噬菌體得到免疫染色(見附圖3)。 (3)噬菌體單克隆的體外靶向鑒定 細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附方法(cell-based ELISA)用于鑒定表I中出現(xiàn)頻率較高的6個(gè)噬菌體克本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一條具有靶向卵巢癌特性的多肽，其特征在于：（1）所述的多肽是利用噬菌體展示隨機(jī)12肽庫(kù)于裸鼠卵巢癌腫瘤模型體內(nèi)篩選得到，其氨基酸序列為：WSGPGVWGASVK；（2）所述的多肽片段可在卵巢癌腫瘤模型體內(nèi)循環(huán)中靶向富集于腫瘤組織；（3）所述的多肽能夠特異性結(jié)合卵巢癌細(xì)胞系SKOV？3？、A2780而對(duì)正常細(xì)胞系3T3、HUVEC，及其他腫瘤細(xì)胞A549、Hela、MG63的結(jié)合能力弱；（4）所述的多肽能通過結(jié)合的細(xì)胞表面受體介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，有助于對(duì)藥物及基因的傳遞。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：尹光福，馬楚穎，魏延，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：四川大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：