本發明專利技術公開了一種通用型水稻工程保持系的培育方法，包括以下步驟：構建顏色標記基因C的雙元表達載體；采用轉基因方法將載體轉入基因型為SS的品種得到轉基因株系；再通過自交繁殖獲得純合株系；分析各純合株系中基因C的插入位點，并篩選、構建得到工程保持系候選庫；將基因型為ss的水稻普通核不育系與該候選庫中的純合株系進行雜交，獲得F1，F1自交繁殖獲得F2，將F2中不帶顏色的種子進行培育，調查培育后各組F2株系中的不育株數，篩選出不育株數占比98%以上的F2來源的F1種子作為工程保持系。本發明專利技術的培育方法具有周期短、通用性強、效率高等優點，培育的工程保持系可在水稻普通核不育系的機械化、規模化繁殖中進行應用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬 于作物不育系的繁殖
，具體涉及一種自花授粉類作物(例如水稻、小麥等)雄性不育系的繁殖方法。
技術介紹
利用植物的雄性不育性培育雄性不育系，再借助這種遺傳工具來大量生產雜交種子，能使許多作物特別是自花授粉作物的雜種優勢得以在生產上應用。按照三型學說，植物的雄性不育分為細胞質雄性不育、細胞核雄性不育和質核互作型雄性不育三種遺傳類型。細胞質雄性不育指不育性狀僅受細胞質基因控制，與細胞核無關，單純由細胞質控制的不育性狀由于找不到恢復系，所以在生產上還沒有應用實例。細胞核雄性不育指不育性狀僅受控于細胞核基因，與細胞質無關，分為顯性核不育和隱性核不育。目前已發現的核不育大多是隱性核不育。質核互作型雄性不育由細胞質基因和細胞核基因共同控制，既有保持系使其不育性得以保持，又能在恢復系的幫助下恢復Fl雜交種的育性，這種類型的不育系與保持系、恢復系形成三系配套，是目前生產上最經典、最成熟的方法，即三系法。但是三系法的育種程序和生產環節較復雜，以致選育新組合的周期長、效率低、推廣環節多、速度慢，同時種子成本高、價格貴。在細胞核雄性不育類型中，隱性核不育依據不育性是否對環境因子敏感，又分為環境敏感核不育和普通核不育。環境敏感核不育，目前主要指光溫敏核不育，其育性既受核不育基因控制，又受外界光照長短和溫度高低的調控，在一定的發育時期，長日、高溫導致不育，短日、低溫導致可育，具有育性轉換的特征，可以一系兩用，比三系減少一系，也即常說的兩系法。光溫敏不育系除了不需要保持系、繁育簡易且效率更高外，還具有1)恢復譜廣，幾乎所有同亞種的正常品種都能使其育性恢復正常；2)遺傳行為簡單，不育性由I 2對隱性基因控制，容易轉育和穩定，有利于培育多種類型的不育系。但是也應當指出，由于光溫敏不育系的育性受外界光照和溫度調控，如果在不育系繁殖過程中光照和氣溫變化不在控制范圍內，將導致光溫敏不育系繁殖減產甚至失敗。普通核不育一般不受外部環境因子的影響，不管環境條件怎樣變化，總是表現為不育，這種不育類型在自然界中比較常見。與質核互作型不育和光溫敏核不育相比，普通核不育具有以下特點1)由于只受一對隱性核基因的控制，且育性不受環境影響，容易選育出不育率和不育株都為100%的普通核不育系；2)育性正常的品種都是它的恢復系，恢復譜及其廣泛，配組自由使得選育優良組合的幾率大增；3)能緊跟常規稻的選育步伐，開辟秈粳亞種間雜種優勢新領域，使水稻產量在現有雜交水稻基礎上實現更高產目標。因此，普通核不育系來源豐富，選育相對簡單，育性穩定，易于恢復，是一種理想的不育材料，但由于這種類型的不育系沒有相應的保持系，且自身不能進行育性轉換，繁殖非常困難，這成為制約其大規模生產利用的關鍵因素。現階段，研究普通核不育系的熱點集中在核不育基因的定位與克隆上，例如CN1884541A號中國專利文獻(申請號為200610027399.8)·中公開了一種“控制水稻絨氈層降解的蛋白編碼序列”，其中，張大兵等通過圖位克隆獲得一個水稻的普通核不育基因7S/ ，功能解析發現該基因編碼的蛋白通過控制水稻絨氈層降解來控制花粉的育性。在普通核不育系的大規模繁殖并應用于實際生產方面，現有文獻中少有報道，目前普通核不育系主要采用回交和無性繁殖來繁殖后代，例如，CN102121052A號中國專利文獻記載了利用分子標記輔助選擇通過回交來創制和繁殖水稻隱性核不育系。CN101946715A號中國專利文獻中記載了利用小孢子培養和無性克隆技術選育和繁殖甘藍型油菜隱性核不育系。另外，有文獻報道水稻的普通核不育系還可以通過再生繁殖，棉花的普通核不育系可以通過扦插來繁殖。通過上述方法，科研工作者可以繁殖得到少量的普通核不育系用于科研和實驗，但是繁殖得到的普通不育系數量稀少，而且需要花費大量的人力物力。如果能解決普通核不育系大規模繁殖的問題，將普通核不育系這一類型大規模應用于雜交制種，將極大地釋放雜種優勢的利用潛力。由于越來越多的研究機構和科研工作者意識到普通核不育系巨大的利用價值和潛力，近期不少研究機構加大了對普通核不育系大規模繁殖問題上的研究投入和研究力度，并且取得了可喜的進展，例如湖南雜交水稻研究中心通過定位和克隆不育基因S和可育基因S，構建工程保持系來繁殖普通核不育系已獲得了成功，但該方法需要克隆不育基因s和可育基因S，加大了工程保持系構建的難度，并大大延長了工程保持系構建的進度。因此，探索一種簡單并且通用性強的普通核不育系的繁殖及創制方法，將為推進普通核不育系大規模應用于生產及進一步釋放雜種優勢的利用潛力方面，具有重大的意義。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種步驟簡單、操作方便、周期短、效率高的通用型水稻工程保持系的培育方法，還相應提供一種通用型水稻工程保持系在水稻普通核不育系繁殖中的應用，該應用能實現水稻普通核不育系的機械化、規模化的繁殖制種，且能夠大大加快普通核不育系從選育到實現應用的過程。為解決上述技術問題，本專利技術提出的技術方案為一種通用型水稻工程保持系的培育方法，包括以下步驟 (1)準備基因型為SS的水稻普通核不育系，s表示控制水稻普通核不育系不育性狀的不育基因； (2)構建顏色標記基因C的雙元表達載體pC； (3)采用現有的轉基因方法(例如農桿菌介導法或基因槍轉化法)將所述雙元表達載體PC轉入基因型為SS的上述水稻普通核不育系的來源親本或育性正常的品種中(S表示對不育基因s顯性的可育基因S)，根據顏色標記基因設計引物，通過PCR篩選得到帶有顏色標記基因C的Ttl代轉基因株系；再將Ttl代轉基因株系通過不斷的自交繁殖獲得帶有單拷貝顏色標記基因的純合株系，其基因型為SSCC (通過測交驗證了其基因型)； (4)分析步驟(3)所獲得的每個純合株系中顏色標記基因C在水稻基因組中的插入位點(插入位點分析方法一般是采用常規的接頭法或TAIL-PCR方法)，并根據顏色標記基因C在水稻基因組的插入位置，篩選出一系列單拷貝的純合株系組庫，使純合株系組庫中的水稻基因組每隔(T2cM就有一個顏色標記基因C，該純合株系組庫即構成了一個工程保持系候選庫； (5)將步驟(I)中的水稻普通核不育系(ss)與步驟(4)中工程保持系候選庫中的每個純合株系(SSCC)進行雜交，獲得F1雜合種子，F1雜合種子自交繁殖一代獲得多種基因型的F2種子，然后通過色選工藝先剔除F2種子中帶有顏色標記基因C的種子，將剩余不帶顏色標記基因C的各組F2種子分別進行培育，獲得對應的各組F2株系，調查前述各組F2株系中的不育株數，篩選出不育株數占比> 98%的F2株系組，并將該F2株系組來源的F1雜合種子作為所述水稻普通核不育系的工程保持系(基因型為上述本專利技術的培育方法中，基因型為的工程保持系雜合種子是根據顏色標記基因C與可育基因S在F2代中的遺傳連鎖分析確證得到，其基于以下基本原理水稻普通核不育系(ss)與工程保持系候選庫中的每一個株系雜交，獲得F1雜合種子，F1雜合種子自交繁殖一代獲得F2種子，通過色選將不攜帶顏色標記基因的F2種子種下去后獲得F2群體，調 查F2群體不育株數，如果不育株數占比為1/4左右時，則分析判定顏色標記C與可育基因S位于不同染色體上；如果不育株數占比大于1/本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種通用型水稻工程保持系的培育方法，包括以下步驟：（1）準備基因型為ss的水稻普通核不育系，s表示控制水稻普通核不育系不育性狀的不育基因；（2）構建顏色標記基因C的雙元表達載體；（3）采用現有的轉基因方法將所述雙元表達載體轉入基因型為SS的上述水稻普通核不育系的來源親本或育性正常的品種中，篩選得到帶有顏色標記基因C的T0代轉基因株系；再將T0代轉基因株系通過不斷的自交繁殖獲得帶有單拷貝顏色標記基因的純合株系，其基因型為SSCC；（4）分析步驟（3）所獲得的每個純合株系中顏色標記基因C在水稻基因組中的插入位點，并根據顏色標記基因C在水稻基因組的插入位置，篩選出一系列單拷貝的純合株系組庫，使純合株系組庫中的水稻基因組每隔0~2cM就有一個顏色標記基因C，該純合株系組庫即構成了一個工程保持系候選庫；（5）將步驟（1）中的水稻普通核不育系與步驟（4）中工程保持系候選庫中的每個純合株系進行雜交，獲得F1雜合種子，F1雜合種子自交繁殖一代獲得多種基因型的F2種子，然后通過色選工藝先剔除F2種子中帶有顏色標記基因C的種子，將剩余不帶顏色標記基因C的各組F2種子分別進行培育，獲得對應的各組F2株系，調查前述各組F2株系中的不育株數，篩選出不育株數占比≥98%的F2株系組，并將該F2株系組來源的F1雜合種子作為所述水稻普通核不育系的工程保持系。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：段美娟，袁定陽，余東，譚炎寧，孫志忠，孫學武，劉瑞芬，袁光杰，袁貴龍，趙炳然，陳良碧，袁隆平，
申請(專利權)人：湖南雜交水稻研究中心，
類型：發明
國別省市：
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