一種定量檢測鹽酸克倫特羅的試劑盒制造技術(shù)

本實(shí)用新型專利技術(shù)公開了一種基于膠體金免疫層析技術(shù)定量檢測鹽酸克倫特羅（CBL）的試劑盒。該試劑盒包括扣卡和膠體金免疫層析試紙條，所述扣卡包括記錄有試劑盒產(chǎn)品信息以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的一維或二維條形碼；當(dāng)與膠體金定量分析儀結(jié)合使用時(shí)，定量分析儀讀取背景、定量帶、質(zhì)控帶的光密度值，以及上述條形碼的標(biāo)準(zhǔn)曲線信息，經(jīng)內(nèi)部軟件計(jì)算得出定量帶校正后的實(shí)際光密度值，再根據(jù)條形碼上所記錄的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過內(nèi)部軟件計(jì)算得出CBL的精確含量。本實(shí)用新型專利技術(shù)試劑盒操作簡便、結(jié)果直觀，并且檢測靈敏度高。（*該技術(shù)在2022年保護(hù)過期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本技術(shù)涉及動(dòng)物性食品、血液及尿液中鹽酸克倫特羅的檢測，特別涉及一種定量檢測動(dòng)物性食品、血液及尿液中鹽酸克倫特羅濃度的試劑盒。
技術(shù)介紹
鹽酸克倫特羅(HCl-clenbuterol))簡稱克倫特羅(CBL)，商品名稱為克喘素、息喘寧、舒喘寧、平喘素、安喘素及瘦肉精，化學(xué)名為a--4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽，分子式為C12H18Cl12N2O · HC1，相對分子質(zhì)量為313. 65。它是一種選擇性β -2腎上腺素受體激動(dòng)劑，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物神經(jīng)興奮及其體內(nèi)營養(yǎng)素重分配的功能。鹽酸克倫特羅(CBL)于1964年首次在美國合成，屬于β-類興奮劑，最初在臨床上主要用于防治人、畜支氣管哮喘和痙攣。1984年美國一家公司意外發(fā)現(xiàn)高于治療劑量5 10倍以上(>1 μ g/kg *d)CBL添加于飼料飼喂動(dòng)物后，可明顯促進(jìn)動(dòng)物生長、改善胴體品質(zhì)、提高瘦肉率，于是歐美等國開始將CBL廣泛用于動(dòng)物飼料。但是，鹽酸克倫特羅的應(yīng)用對動(dòng)物有害，在飼用初期會(huì)在短期內(nèi)出現(xiàn)如下癥狀血壓升高、血管擴(kuò)張、心率加快、呼吸加劇、體溫上升、心臟和腎臟負(fù)擔(dān)加重等劇烈反應(yīng)，并出現(xiàn)采食下降、行為動(dòng)作失調(diào)、神經(jīng)緊張不安甚至全身震顫等癥狀。人食用了含有克喘素等鹽酸克倫特羅殘留的肉食，會(huì)出現(xiàn)類似于動(dòng)物甚至比動(dòng)物更嚴(yán)重的癥狀。鹽酸克倫特羅對人體危害的持續(xù)時(shí)間較長，雖然目前未有中毒患者死亡的報(bào)道，但給患者的精神、健康及正常生活工作造成了嚴(yán)重危害。我國政府嚴(yán)令申明不得在家畜的飼料及其他添加物中使用鹽酸克倫特羅，并且通過相關(guān)政策手段對相關(guān)領(lǐng)域進(jìn)行行政干預(yù)和抽檢。限制鹽酸克倫特羅濫用的有力手段之一即為現(xiàn)場快速檢測，因此市場急切的需要一種快捷簡單、價(jià)格低廉、不依賴任何儀器設(shè)備，同時(shí)又能準(zhǔn)確、靈敏的檢測鹽酸克倫特羅的手段，這一手段可以供所有檢驗(yàn)檢疫部門甚至消費(fèi)者自己使用，為使用者提供鹽酸克倫特羅濃度的基本信息，為是否需要進(jìn)行下一步精確檢測提供依據(jù)。以膠體金試紙條技術(shù)為代表的快速膜檢測技術(shù)作為一種穩(wěn)定和實(shí)用的技術(shù)，適合在多樣情況下使用。目前，膠體金試紙條技術(shù)進(jìn)行定量或半定量檢測的方式主要有三種第一種，簡單根據(jù)測試結(jié)果信號在視覺上的對比，提供半定量結(jié)果，可分為陰性、弱陽性、中陽性和強(qiáng)陽性；第二種，在檢測區(qū)域設(shè)計(jì)多條檢測線，每條檢測線設(shè)計(jì)成只結(jié)合已知一定量的分析物，當(dāng)分析物過量或不足量時(shí)，分析物將會(huì)和下一條檢測線結(jié)合，這樣會(huì)在測試區(qū)產(chǎn)生一個(gè)溫度計(jì)式的條帶梯度，因此可以根據(jù)檢測結(jié)果中出現(xiàn)檢測線的多少，判斷樣品中被測物的濃度范圍。第三種，測試樣品所產(chǎn)生的信號由一個(gè)小型的、便攜式的分析儀讀取，并由分析儀將有色的測試線轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，從而根據(jù)信號的強(qiáng)弱判斷被測物的量；此類型的最終檢測結(jié)果仍以陰性、弱陽性、中陽性和強(qiáng)陽性表示，并沒有快捷地給出CBL的精確含量。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本技術(shù)要解決的技術(shù)問題為提供一種定量檢測鹽酸克倫特羅的試劑盒，在與配套的膠體金定量分析儀結(jié)合使用時(shí)，可以得到樣品中鹽酸克倫特羅的準(zhǔn)確含量。為解決上述技術(shù)問題，本技術(shù)提供了一種定量檢測鹽酸克倫特羅的試劑盒，包括扣卡和膠體金免疫層析試紙條；所述扣卡包括記錄有試劑盒產(chǎn)品信息以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的一維或二維條形碼；所述膠體金免疫層析試紙條包括樣品墊(I)、結(jié)合墊(2)、層析膜(3)、吸水墊(4)和背襯墊(7)，其中樣品墊(I)、結(jié)合墊(2)、層析膜(3)和吸水墊(4)搭載于背襯墊(7)之上，樣品墊(I)連接于結(jié)合墊(2)，結(jié)合墊(2)連接于層析膜(3)，層析膜(3)上設(shè)置有質(zhì)控帶(5)和定量帶(6)，層析膜(3)連接于吸水墊(4)。上述試劑盒中，所述定量帶包被有鹽酸克倫特羅-BSA抗原，所述質(zhì)控帶包被有無關(guān)抗原，所述結(jié)合墊上固定有膠體金標(biāo)記的抗鹽酸克倫特羅抗體和膠體金標(biāo)記的抗所述無關(guān)抗原的抗體；所述抗無關(guān)抗原的抗體與所述鹽酸克倫特羅-BSA抗原無非特異性免疫反 應(yīng)，所述抗鹽酸克倫特羅抗體與所述無關(guān)抗原無非特異性免疫反應(yīng)。在具體的實(shí)施例中，所述抗鹽酸克倫特羅的抗體為鼠源單克隆抗體，所述無關(guān)抗原為兔免疫球蛋白IgG，所述抗無關(guān)抗原的抗體為羊抗兔IgG抗體。上述試劑盒中，所述膠體金的顆粒大小為25 30nm,采用鞋酸-朽1檬酸鈉還原法制備膠體金分散顆粒，具體步驟如下將超純水加熱到60°C，然后加入1%氯化金溶液2ml，攪拌Imin后，向其中快速加入還原劑(I %檸檬酸鈉，O. 5%單寧酸)4ml，繼續(xù)攪拌，反應(yīng)持續(xù)大約lOmin，此時(shí)顏色由黑變藍(lán)再變?yōu)榱良t(近似紅葡萄酒顏色)，然后用冷水浴使反應(yīng)溶液降到室溫。所述膠體金標(biāo)記抗體的制備方法為取膠體金1ml，至攪拌器上勻速攪拌；加入5 10 μ I O. 2Μ K2CO3調(diào)整PH及形成一個(gè)標(biāo)記緩沖體系；將5 10 μ g抗體用純水稀釋至5(Γ 00μ 1，逐滴加入至Iml金液中，標(biāo)記攪拌時(shí)間Ih ;勻速加入50 μ I 10%BSA進(jìn)行封閉，攪拌時(shí)間 O. 5h ;平衡離心，12000r/min,25min ;棄上清，用 O. 02mol/L, pH 8. O 的 Tris-HCl緩沖液復(fù)溶沉淀物至100 μ I ;加入20%蔗糖和5%海藻糖。所述試劑盒可以檢測動(dòng)物肌肉及組織、動(dòng)物尿液和血液等，根據(jù)樣品的不同，前處理的方法不同。當(dāng)樣品為尿液和血清時(shí)，可以直接檢測；當(dāng)樣品為動(dòng)物肌肉或組織時(shí)，前處理方法如下將精肉或內(nèi)臟樣本4克以上(越細(xì)越好)，裝入5ml的離心管中(以裝滿管子四分之三為宜)，擰緊管蓋(不要讓水進(jìn)入管子內(nèi))。將裝有樣品的離心管在90°C以上水浴加熱(采用耐高溫的容器例如鋁飯盒等，注入水，升溫至90°C以上，將離心管放入容器內(nèi)水浴中加熱)10分鐘后(肉熟透為準(zhǔn))取出冷卻至室溫。取3滴(約100 μ I)配套的PBST緩沖液，到1.5ml的小離心管中，然后甩凈吸管內(nèi)的殘留液，用此吸管吸取煮出的樣品滲出液，加3滴(約100 μ I)到I. 5ml小離心管中，充分混合，待測。本技術(shù)試劑盒檢測鹽酸克倫特羅的原理取一定量樣品溶液加入樣品墊，樣本和被溶解的膠體金抗體結(jié)合物一起在過濾片上移動(dòng)。如果樣品溶液含有鹽酸克倫特羅的殘留，鹽酸克倫特羅將和抗體先行反應(yīng)，因此當(dāng)擴(kuò)散至定量帶時(shí)，抗體的活性位點(diǎn)將因被樣品溶液中的CBL占據(jù)而無法與定量帶上CBL抗原結(jié)合。當(dāng)樣品中的CBL含量超過試劑板檢出限時(shí)，試劑板上的定量帶將較質(zhì)控帶顯色淡或甚至無顯色。反之，當(dāng)樣品中CBL含量在試劑板檢出限以下或無殘留時(shí)，試劑板上的定量帶顯色與質(zhì)控帶相近或偏深。本技術(shù)試劑盒與膠體金定量分析儀結(jié)合使用定量檢測待檢樣品中CBL含量的原理膠體金定 量分析儀的光學(xué)系統(tǒng)采用了一個(gè)CMOS數(shù)字圖像傳感器，掃描并讀取背景、定量帶和質(zhì)控帶的光密度信息，以及上述一維或二維條形碼所記錄的標(biāo)準(zhǔn)曲線。讀取的背景及條帶(定量帶和質(zhì)控帶)的光密度值為原始反射密度值，經(jīng)過內(nèi)部計(jì)算得到扣除背景噪聲并經(jīng)質(zhì)控帶校正后的實(shí)際光密度值(質(zhì)控帶用于校正環(huán)境因素如溫度、濕度等對條帶強(qiáng)度的影響)，即實(shí)際光密度值=(背景值-定量帶值)/質(zhì)控帶值，具體處理過程包括以下幾個(gè)步驟I、條帶區(qū)域采集系統(tǒng)截取條帶區(qū)域，為條帶上下左右Imm范圍內(nèi)的矩形區(qū)域；2、選取條帶區(qū)域內(nèi)的光密度峰值，并通過內(nèi)部處理去除條帶區(qū)域內(nèi)的非特異光密度峰，以使結(jié)果更本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種定量檢測鹽酸克倫特羅的試劑盒，包括扣卡和膠體金免疫層析試紙條；所述扣卡包括記錄有試劑盒產(chǎn)品信息以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的一維或二維條形碼；所述膠體金免疫層析試紙條包括樣品墊（1）、結(jié)合墊（2）、層析膜（3）、吸水墊（4）和背襯墊（7），其中樣品墊（1）、結(jié)合墊（2）、層析膜（3）和吸水墊（4）搭載于背襯墊（7）之上，樣品墊（1）連接于結(jié)合墊（2），結(jié)合墊（2）連接于層析膜（3），層析膜（3）上設(shè)置有質(zhì)控帶（5）和定量帶（6），層析膜（3）連接于吸水墊（4）。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王金愛，
申請(專利權(quán))人：北京康美天鴻生物科技有限公司，
類型：實(shí)用新型
國別省市：