納他霉素的一種分離純化方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種從發(fā)酵液中分離純化納他霉素的方法：將納他霉素發(fā)酵液用草酸調(diào)pH值后依次加入黃血鹽和硫酸鋅，再加入聚丙烯酸鈉，經(jīng)廂式隔膜壓濾機(jī)過(guò)濾、超濾提純后納濾純化、結(jié)晶、真空干燥后制得納他霉素。本發(fā)明專利技術(shù)采用先超濾后納濾的提取技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的萃取工藝，可節(jié)約提取成本、減少環(huán)境污染、降低能耗，具有工藝簡(jiǎn)便、收率高(≥65％)、純度高(干基含量≥95％)、成本低的特點(diǎn)，適于工業(yè)化生產(chǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種從發(fā)酵液中分離純化納他霉素的方法，屬于工業(yè)微生物

技術(shù)介紹
納他霉素是一種多烯烴，其分子是一種具有活性的環(huán)狀四烯化合物，含3個(gè)以上的結(jié)晶水，其外觀白色(或奶油色)，為無(wú)味的結(jié)晶粉末，分子式C33H47NO13，分子量為665. 73。納他霉素是一種兩性物質(zhì)，分子中具有一個(gè)堿性基團(tuán)和一個(gè)酸性基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)上存在兩種典型構(gòu)型烯醇式結(jié)構(gòu)和酮式結(jié)構(gòu)，這就決定了它在許多溶劑中的低溶解性。1981 年，Brik指出當(dāng)室溫條件下，納他霉素在水中的溶解度為30 100mg/L，在水和較低級(jí)醇類中，隨著PH值的升高與降低，納他霉素的溶解性增加，在中性pH下溶解度最低，而在pH低于3或高于9時(shí)溶解度增大。納他霉素是一種高效、廣譜的真菌抑制劑，其抗菌機(jī)理在于它能與細(xì)胞膜上的甾醇化合物反應(yīng)，由此引發(fā)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變而破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的滲漏，使細(xì)胞死亡。但細(xì)菌的細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)膜不存在這些類甾醇化合物，所以納他霉素對(duì)細(xì)菌沒(méi)有作用。納他霉素對(duì)幾乎所有的霉菌和酵母具有抗性，是一種廣譜的抗霉菌、酵母菌、某些原生動(dòng)物和某些藻類的多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，但對(duì)細(xì)菌和病毒無(wú)效。1972年，美國(guó)FDA建議納他霉素作為食品添加劑使用的抗生素，還被歸類為GRAS產(chǎn)品之列。我國(guó)1996年中食品添加劑委員會(huì)對(duì)納他霉素進(jìn)行評(píng)價(jià)并建議批準(zhǔn)使用，現(xiàn)已列入食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)，其商品名稱為霉克(NatamaxinTM)。美國(guó)CFR編碼21CFR172. 155，其中對(duì)納他霉素的DAI值是O. 3mg/kg，根據(jù)我國(guó)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760)規(guī)定，食物中最大殘留量是10mg/kg，而納他霉素在實(shí)際應(yīng)用中的使用量為10_6數(shù)量級(jí)。醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用方面納他霉素在治療真菌引起的疾病方面也有良好的應(yīng)用。最近納他霉素在醫(yī)學(xué)上特別是在眼角膜真菌感染方面的研究和報(bào)道層出不窮。它對(duì)口腔念球菌的感染有非常明顯的治療效果。另外也可應(yīng)用于陰道及肺曲霉病的治療。此外納他霉素在青貯飼料方面以及作為抗真菌藥物用于水果、種子馬鈴薯和水仙球莖都有良好的應(yīng)用效果。納他霉素是通過(guò)發(fā)酵法制備的，產(chǎn)生菌一般為納塔爾鏈霉菌、褐黃孢鏈霉菌等。納他霉素在通常條件下不溶于水，常用一些有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，如美國(guó)專利3，892，850、W092/07998.W092/1058中均采取有機(jī)溶劑提取的方法。這些方法需要使用甲醇、異丙醇等易燃、易揮發(fā)的有機(jī)溶劑，勢(shì)必導(dǎo)致較高的溶劑損耗、回收費(fèi)用以及較高的安全設(shè)施要求、高昂的環(huán)保費(fèi)用。而且甲醇的使用，容易導(dǎo)致納他霉素甲酯這種副產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而影響產(chǎn)品的純度。W097/29207公布了一種不需有機(jī)溶媒提取納他霉素的方法，該方法先使用物理或化學(xué)的方法使發(fā)酵液中菌絲體細(xì)胞破碎、降解，發(fā)酵液中的納他霉素固體懸浮在水相中，然后通過(guò)應(yīng)用重力梯度離心技術(shù)使納他霉素固體與細(xì)胞碎片分離得到產(chǎn)品。該方法具有工藝路線短的優(yōu)點(diǎn)，但此工藝對(duì)發(fā)酵液中納他霉素的含量要求較高(大于7g/L)，同時(shí)對(duì)發(fā)酵液中的納他霉素晶體大小及均一度都有嚴(yán)格的要求。另外，此工藝對(duì)分離設(shè)備要求極高，同時(shí)需要高額的設(shè)備維護(hù)費(fèi)用，因此該提取方法的應(yīng)用具有一定的局限性。在中國(guó)國(guó)家專利CN101062934A中，公開(kāi)了一種不使用有機(jī)溶劑從發(fā)酵液中提取納他霉素的方法。該專利是利用那他霉素在不同PH條件下的水溶液中溶解度不同的性質(zhì)，來(lái)實(shí)現(xiàn)那他霉素的提取。在其堿化過(guò)程中，發(fā)酵液的PH值均要求在11以上，這樣勢(shì)必使用大量的堿液來(lái)調(diào)節(jié)原本顯酸性的發(fā)酵液。該方法雖然避免了有機(jī)溶劑使用，但大量酸堿的使用同樣會(huì)帶來(lái)不可預(yù)知的環(huán)保問(wèn)題和酸堿的消耗、回收問(wèn)題。另外，由于發(fā)酵液中納他霉素的含量較低，這些方法在進(jìn)行提取前都需要進(jìn)行發(fā)酵液的濃縮處理，以提高提取得率及純度，這樣勢(shì)必增加生產(chǎn)中的能耗。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種從生物發(fā)酵液中提取純化納他霉素的工藝方法，以非有機(jī)溶媒法從發(fā)酵液中提取納他霉素為特征，解決了有機(jī)溶媒法提取納他霉素造成的納他霉素提取純化過(guò)程中有機(jī)溶媒損耗量高、工序長(zhǎng)造成的生產(chǎn)成本較高的問(wèn)題。 本專利技術(shù)的目的是通過(guò)以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的I、取10 40L的納他霉素發(fā)酵液，用草酸調(diào)pH至2. 8 3. 0，依次加入黃血鹽和硫酸鋅，攪拌，處理約O. 5h，再加入聚丙烯酸鈉，溫度控制在30°C以下，總處理時(shí)間不超過(guò)3h。2、將處理好的納他霉素發(fā)酵液在O. 05 O. 07Mpa壓力下，經(jīng)廂式隔膜壓濾機(jī)過(guò)濾得澄清透明濾液，進(jìn)行膜提取。3、由于采用菌株發(fā)酵，發(fā)酵液中常存在菌絲體、蛋白質(zhì)和懸浮微粒等雜質(zhì)。納他霉素發(fā)酵液中的菌絲體比共存的蛋白質(zhì)、糖類和膠體分子大得多，可以利用流體壓力采用無(wú)機(jī)膜將噬菌體和溶液分離，簡(jiǎn)化工藝流程，降低過(guò)濾成本，減輕勞動(dòng)強(qiáng)度，減少環(huán)境污染，同時(shí)濾液質(zhì)量和產(chǎn)品收率得到明顯提高。無(wú)機(jī)膜具有化學(xué)穩(wěn)定性好，機(jī)械強(qiáng)度高，高孔徑分布窄等優(yōu)點(diǎn)，在食品和發(fā)酵行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。采用鈦合金膜分離裝置(帶反沖系統(tǒng))，膜過(guò)濾孔徑O. I μ m，多通道管式膜過(guò)濾面積(O. 25 ± O. 05) m2。配儲(chǔ)液罐40L，鈦合金膜管O. I μ m，pH值6. O 7. O、操作壓力O. 2 I. 2MPa、操作時(shí)間20 120min、膜表面流速2 8m/s、溫度60 75 °C條件下對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行超濾提純。4、納濾介于超濾和反滲透之間，孔徑納米級(jí)，截留分子量數(shù)百級(jí)，可對(duì)分子量低于1000的物質(zhì)進(jìn)行分離和濃縮。納他霉素分子量為665. 7，而且超濾后濾液具有較高的鹽含量，可以用納濾膜進(jìn)行脫鹽和濃縮。選用MWCO為200的聚砜納濾膜件，進(jìn)料壓力O. 2 I. 2MPa、pH值5. O 9. O、濃縮倍數(shù)4 8的條件下進(jìn)行納濾。5、納濾液經(jīng)緩慢攪拌，白色結(jié)晶析出，50°C真空干燥，得到納他霉素白色結(jié)晶粉末。本專利技術(shù)具有工藝簡(jiǎn)便、收率高、純度高(干基含量>95%)、不使用有機(jī)溶媒、成本低、環(huán)保、對(duì)發(fā)酵液及設(shè)備的特性要求低等特點(diǎn)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例I，按以下步驟依次進(jìn)行I、取20L(納他霉素含量為9. Og/L)發(fā)酵液，用草酸調(diào)pH至3. 0，依次加入黃血鹽和硫酸鋅，攪拌，處理約O. 5h，再加入聚丙烯酸鈉，溫度控制在30°C以下，總處理時(shí)間不超過(guò)3h。2、將處理好的納他霉素發(fā)酵液在O. 05Mpa壓力下，經(jīng)廂式隔膜壓濾機(jī)過(guò)濾得澄清透明濾液，進(jìn)行膜提取。3、采用鈦合金膜分離裝置(帶反沖系統(tǒng))，膜過(guò)濾孔徑O. I μ m，多通道管式膜過(guò)濾面積(O. 25±O. 05)m2。配儲(chǔ)液罐40L，鈦合金膜管O. I μ m，pH值6· O、操作壓力O. 6MPa、操作時(shí)間60min、膜表面流速5m/s、溫度65°C條件下對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行超濾提純。4、選用MWCO為200的聚砜納濾膜件，進(jìn)料壓力I. OMPa, pH值7. O、濃縮倍數(shù)5的條件下進(jìn)行納濾。5、納濾液經(jīng)緩慢攪拌，白色結(jié)晶析出，50°C真空干燥，得到納他霉素白色結(jié)晶粉末，純度為95.8%，水分7.0%，收率66. 5 %。實(shí)施例2，按以下步驟依次進(jìn)行I、取30L的納他霉素發(fā)酵液，用草酸調(diào)pH至2. 8，依次加入黃血鹽和硫酸鋅，攪拌，處理約O. 5h，再加入聚丙烯酸鈉，溫度控制在30°C以下，總處理時(shí)間不超過(guò)3h。 2、將處理好的納他霉素發(fā)酵液在O. 07M本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
納他霉素的一種分離純化方法，其特征在于：1)取一定量的納他霉素發(fā)酵液，草酸調(diào)pH，依次加入黃血鹽和硫酸鋅，攪拌，再加入聚丙烯酸鈉，控制溫度和處理時(shí)間。2)將處理好的納他霉素發(fā)酵液在一定壓力下，經(jīng)廂式隔膜壓濾機(jī)過(guò)濾得澄清透明濾液，進(jìn)行膜提取。3)在一定pH值、操作壓力、操作時(shí)間、膜表面流速、溫度條件下對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行超濾提純。4)在一定進(jìn)料壓力、pH值、濃縮倍數(shù)條件下進(jìn)行納濾。5)納濾液經(jīng)緩慢攪拌，白色結(jié)晶析出，真空干燥，得到納他霉素白色結(jié)晶粉末，純度＝95.0％。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊旭錦，石慧，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京明新高科技發(fā)展有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：