不溶性目標蛋白質(zhì)的分離制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及從完整或破碎的宿主細胞的懸液中分離不溶性目標蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及可通過所述方法獲得的不溶性目標蛋白質(zhì)，尤其是絲蛋白。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】不溶性目標蛋白質(zhì)的分離本專利技術(shù)涉及從完整或破碎的宿主細胞的懸液中分離不溶性目標蛋白質(zhì)的方法。本專利技術(shù)還涉及可通過所述方法獲得的不溶性目標蛋白質(zhì)。
技術(shù)介紹
之前已經(jīng)開發(fā)了從宿主細胞(例如微生物細胞)的懸液和/或從 其他不純物質(zhì)中分離目標蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，因而這是現(xiàn)有技術(shù)知識。例如，參考利用色譜技術(shù)(如離子交換色譜或尺寸排阻色譜)純化和分離可溶性目標蛋白質(zhì)的標準蛋白質(zhì)純化方法(Guide to Protein Purification, Academic PressVol. 182，1990)。目前使用的其他技術(shù)為液-液相分離和超濾等(Guide to ProteinPurification,Academic Press Vol. 182,1990)。通過進行一些變化，可以改變這些基本的純化方法以純化科學或工業(yè)目的所需的大多數(shù)蛋白質(zhì)，但是，它們一般成本非常高、復雜且耗時。特別地,在Huemmerich 等,Biochemistry 2004,43,13604-13612 中描述了專門處理絲蛋白的方法。該文獻中的技術(shù)在目標蛋白質(zhì)沉淀步驟之后進行利用宿主細胞蛋白質(zhì)的熱變性的技術(shù)，但是缺少色譜純化方法，該技術(shù)被成功用于純化技術(shù)應用的重組蛛絲蛋白。因為絲蛋白質(zhì)傾向于自聚集，所以該方法會造成相當大部分目標蛋白質(zhì)的損失，目標蛋白質(zhì)沉淀并因此難以用可溶性蛋白質(zhì)的純化方法獲得。盡管所述方法很好地用于大多數(shù)可溶性蛋白質(zhì)，但是顯然的是當處理有聚集傾向的蛋白質(zhì)時有嚴重不足。這些有聚集傾向的蛋白質(zhì)在溶液中經(jīng)過一段時間后傾向于沉淀，產(chǎn)生穩(wěn)定的、通常不溶的蛋白質(zhì)聚集物。這些蛋白質(zhì)聚集物不可以再利用所述可溶性蛋白質(zhì)級分純化方法進行分離。因此，發(fā)酵時間和/或純化時間一般為避免不期望沉淀的關(guān)鍵參數(shù)。已知可以利用數(shù)種去污劑來溶解所述蛋白質(zhì)聚集物，但是，還已知這樣的溶解對蛋白質(zhì)產(chǎn)量和蛋白質(zhì)質(zhì)量有不利影響。此外，經(jīng)過延長的時間來完全溶解蛋白質(zhì)聚集物幾乎不可能。因此，需要開發(fā)有聚集傾向的目標蛋白質(zhì)和/或已聚集的目標蛋白質(zhì)的純化/分離方法，其主要從包含不溶性宿主細胞蛋白質(zhì)和其他殘留物的級分中分離有聚集傾向的目標蛋白質(zhì)級分和/或聚集的目標蛋白質(zhì)級分，而不完全溶解所述目標蛋白質(zhì)。這種純化方法應該允許從宿主細胞(如微生物細胞)和/或其他細胞殘留物的懸液中以高產(chǎn)量和高質(zhì)量分離不溶性目標蛋白質(zhì)。這種純化方法還應當經(jīng)濟、快速、簡單和可重現(xiàn)。本專利技術(shù)人出乎意料地發(fā)現(xiàn)目標蛋白質(zhì)是不溶的，并且在溶解全部或幾乎全部其他不溶性宿主蛋白質(zhì)、宿主細胞殘留物和/或其他潛在發(fā)酵相關(guān)雜質(zhì)所必需的特定條件下依然不溶，并且發(fā)現(xiàn)這使得能夠通過很少的純化步驟來分離和純化這些目標蛋白質(zhì)，而不會因為所述目標蛋白質(zhì)的不期望溶解或其他交叉反應而使所述目標蛋白質(zhì)的量顯著損失。出乎意料地，通過根據(jù)本專利技術(shù)的方法將不溶性目標蛋白質(zhì)與溶解的不溶性宿主細胞部分分離，可以實現(xiàn)純度優(yōu)選為至少80%的不溶性目標蛋白質(zhì)的純化。甚至當一些不溶性宿主細胞部分不完全溶解而殘留在懸液中時，依然可以實現(xiàn)有效分離，這是因為這些懸浮的宿主細胞部分的比重低于不溶性目標蛋白質(zhì)的比重，使得允許通過離心、沉降和/或過濾來有效分離。相比于已知的純化技術(shù)，本專利技術(shù)的方法提供了若干顯著優(yōu)點。例如，本專利技術(shù)方法減少了復雜的純化步驟數(shù)，因此是快速、可靠并且易于進行的純化方法。此外，所述方法允許以高產(chǎn)量和質(zhì)量純化/分離不溶性目標蛋白質(zhì)。相比于常規(guī)方法，所述方法能夠顯著降低成本。此外，所述方法很環(huán)保。盡管本專利技術(shù)方法僅包括幾個方法步驟，但是迄今為止沒有完全預見到的是，一些目標蛋白質(zhì)不溶并且在所用條件下保持不溶。尤其是考慮到在洗滌和清潔與蛋白質(zhì)和細胞接觸之生物反應器和反應罐時通常采用的堿濃度( O. IM NaOH)的背景下。因此很難不證自明這些條件也可以用于大規(guī)模純化不溶性目標蛋白質(zhì)。專利技術(shù)概述在第一方面中，本專利技術(shù)提供了從完整或破碎的宿主細胞的懸液中分離不溶性目標蛋白質(zhì)的方法，其包括以下步驟a)提供包含不溶性目標蛋白質(zhì)和不溶性宿主細胞部分的完整或破碎的宿主細胞的懸液，b)向所述懸液中加入至少一種堿的水溶液，其量足以破碎所述宿主細胞和/或溶解所述不溶性宿主細胞部分，以及c)使不溶性目標蛋白質(zhì)與溶解的不溶性宿主細胞部分分離，其中在步驟b)中，目標蛋白質(zhì)保持不溶，并且其中至少80%的不溶性宿主細胞部分溶解。在第二方面中，本專利技術(shù)涉及可通過第一方面的方法獲得的不溶性目標蛋白質(zhì)。 本專利技術(shù)的該概述不一定描述本專利技術(shù)的全部特征。專利技術(shù)詳述在詳細描述本專利技術(shù)之前，應當理解本專利技術(shù)并不局限于本文所述的具體方法、方案和試劑，因為這些可以不同。還應當理解本文所用術(shù)語的目的僅為描述具體實施方案，而不是意在限制本專利技術(shù)的范圍，該范圍僅由所附權(quán)利要求限制。除非本文另外定義，否則本文所使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語的意思與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意思相同。優(yōu)選地，本文所用術(shù)語的定義如“A multilingual glossary ofbiotechnological terms (IUPAC Recommendations)，，，Leuenberger, H. G. ff, Nagel, B.和KolbIs H.編輯(1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010Basel, Switzerland)所足義。在本說明書全文中引用了幾篇文獻。無論是上文還是下文，本文所引用的每一篇文獻(包括全部的專利、專利申請、科學出版物、制造商說明書、使用說明書、GenBank登錄號序列提交等)均通過引用整體并入本文。不應將本文中的任何內(nèi)容解釋為承認本專利技術(shù)不享有借助在先專利技術(shù)早于這些公開內(nèi)容的權(quán)利。接下來將描述本專利技術(shù)的要素。這些要素用具體實施方案列舉，但是應當理解這些要素可以以任何方式和任何數(shù)量組合，從而產(chǎn)生另外的實施方案。多種描述的實施例和優(yōu)選實施方案不應當被理解為將本專利技術(shù)僅限制為具體描述的實施方案。應當將本說明書理解為支持和涵蓋組合了明確描述的實施方案以及任意數(shù)量之公開和/或優(yōu)選要素的實施方案。此外，除非上下文另外指出，否則應認為本申請描述的所有要素的任意排列和組合是本申請說明書所公開的。在本說明書及權(quán)利要求全文中，除非上下文另外指出，否則應當將詞“包括”及其變化形式“包含”和“含有”理解為包括所述整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組。除非本文另外明確表明，在本說明書及所附權(quán)利要求中不使用數(shù)量詞時包括復數(shù)的指示對象。如果殘基占據(jù)了兩個或更多個多肽結(jié)構(gòu)中的類似位點，那么就說多肽中的這些殘基彼此“對應”。本領(lǐng)域公知兩個或更多個多肽中的類似位點可以通過基于氨基酸序列或結(jié)構(gòu)相似性的多肽序列比對來確定。這些比對工具對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，并且可以例如，獲自萬維網(wǎng)，如ClustalW(www. ebi.ac.uk/clustalw)或利用標準設(shè)定(優(yōu)選AlignEMBOSS: :needle, Matrix :Blosum62,缺口打開 10. 0,缺口延伸 O. 5)的 Align (http: //www.ebi. ac. uk/emboss/align/index, html)。在第一方面中，本專利技術(shù)提供了從完整或破碎的宿主細胞的懸液中分離不溶本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2010.03.31 US 61/319,5421.從完整或破碎的宿主細胞的懸液中分離不溶性目標蛋白質(zhì)的方法，其包括以下步驟 a)提供包含不溶性目標蛋白質(zhì)和不溶性宿主細胞部分的完整或破碎的宿主細胞的懸液， b)向所述懸液中加入至少一種堿的水溶液，其量足以破碎所述宿主細胞和/或溶解所述不溶性宿主細胞部分，以及 c)使所述不溶性目標蛋白質(zhì)與溶解的所述不溶性宿主細胞部分相分離， 其中在步驟b)中，所述目標蛋白質(zhì)保持不溶，并且其中至少80%的所述不溶性宿主細胞部分被溶解。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述宿主細胞為細菌、酵母、植物或昆蟲宿主細胞。3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中分離的所述不溶性目標蛋白質(zhì)的純度為至少80%、優(yōu)選至少90%，以及更優(yōu)選至少95%。4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的方法，其中所述堿為金屬氫氧化物和/或氨。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其中所述金屬氫氧化物選自氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鉀(KOH)和氫氧化鈣(CaOH)，或其組合。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述堿為氫氧化鈉(NaOH)。7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項所述的方法，其中步驟(b)中所述堿的最終濃度為O.005M至1M、優(yōu)選O. OlM至O. 6M、更優(yōu)選O. 02M至O. 2M,以及最優(yōu)選O. 04M至O. 06M。8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項所述的方法，其中所述方法還包括(i)在步驟b)之前、( )在步驟b)中和/或(iii)在步驟b)之后加入至少一種試劑。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述試劑選自變性劑、親液劑和去污劑，或其組入口 ο10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中 (i)所述變性劑為尿素(CH4N2O)或鹽酸胍(CH5N3HCl)， (ii)所述親液劑為磷酸鹽或硫酸鹽，或者 (iii)所述去污劑為吐溫20、TritonX-100、SDS或j。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中 (i)尿素的最終濃度為O.IM至10M，優(yōu)選IM至5M，或者 (ii)鹽酸胍的最終濃度為O.OlM至3M，優(yōu)選O. IM至2M。12.根據(jù)權(quán)利要求I至11中任一項所述的方法，其中步驟c)中所述不溶性目標蛋白質(zhì)與所述溶解的不溶性宿主細胞部分的所述分離通過離心、沉降和/或過濾來實現(xiàn)。13.根據(jù)權(quán)利要求I至12中任一項所述的方法，其中所述方法在步驟b)之后和步驟c)之前還包括使所述懸液均化的步驟b’)。14.根據(jù)權(quán)利要求I至13中任一項所述的方法，其中所述方法在步驟c)之后還包括步驟d)，其中用水溶液、有機溶液和/或尿素洗滌分離的所述不溶性目標蛋白質(zhì)，優(yōu)選離心物、沉降物或截留物。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述有機溶液包含乙醇(EtOH)、甲醇(CH3OH)、己烷(C6H14)、乙醚(C4H10O)和/或異丙醇(C3H8O)。16.根據(jù)權(quán)利要求I至15中任一項所述的方法，其中在步驟b)中加入包含至少一種堿的水溶液之后，在15°C至25°C的溫度下，經(jīng)10分鐘至40分鐘的時間，所述目標蛋白質(zhì)的至少90%、優(yōu)選至少95%保持不溶。17.根據(jù)權(quán)利要求I至16中任一項所述的方法，其中所述不溶性目標蛋白質(zhì)形成包含至少85%所述目標蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)聚集物。18.根據(jù)權(quán)利要求I至17中任一項所述的方法...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馬丁·施密特，阿克塞爾·萊默爾，林·勒默爾，
申請(專利權(quán))人：安西爾克公司，
類型：
國別省市：