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    源自瘧原蟲屬感染之網織紅細胞的外來體,其獲得方法及用途技術

    技術編號:8133233 閱讀:234 留言:0更新日期:2012-12-27 07:03
    本發明專利技術所屬領域為用于防止和預防瘧疾的疫苗,更具體地,本發明專利技術涉及分離自瘧原蟲屬(Plasmodium?sp.)感染之網織紅細胞的外來體、獲得所述外來體的方法和所述外來體在防止和預防瘧疾中的用途,以及其在發現和鑒定新的瘧原蟲抗原中的用途。本發明專利技術還涉及包含瘧原蟲屬抗原的人工外來體。最后,本發明專利技術涉及借助用瘧原蟲屬感染網織紅細胞所獲得的外來體發現的特異性抗原。

    【技術實現步驟摘要】
    【國外來華專利技術】
    本專利技術所屬領域為用于防止和預防瘧疾的疫苗,更具體地,本專利技術涉及分離自瘧原蟲屬(Plasmodium sp.)感染之網織紅細胞的外來體、獲得其的方法和所述外來體在防止和預防瘧疾中的用途,以及其在發現和鑒定新的瘧原蟲抗原中的用途。本專利技術還涉及包含瘧原蟲屬抗原的人工外來體。最后,本專利技術涉及借助用瘧原蟲屬感染網織紅細胞所獲得的外來體發現的特異性抗原。
    技術介紹
    瘧原蟲屬是引起瘧疾(也被稱為“瘴氣(puladism) ”)的病原體。在瘧原蟲屬中有不同的物種,其中一些是無害的。相反地,另ー些物種有高度感染性并且是引起全球大多數人類瘧疾的原因。在后者中,最重要的物種是惡性瘧原蟲(P. falciparum)和間日瘧原蟲(P. vivaxノ。所有人類瘧原蟲物種(惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲(p.malariae)、卵形瘧原蟲(P. ovale)、諾氏瘧原蟲(P. knowlesi))均不同程度地感染紅細胞和/或其前體網織 紅細胞,網織紅細胞需要成熟和分化過程以達到它們作為紅細胞的最終功能狀態。在不同的瘧原蟲物種當中,有些物種具有比其他物種更高的網織紅細胞感染能力,例如主要感染該細胞類型的間日瘧原蟲。在網織紅細胞成熟井分化成紅細胞的過程中,紅細胞中不必要的ー些蛋白質被隔絕在位于多囊體(multi-vesicular body,MVB)的內部囊泡中,隨后作為小的納米囊泡(被稱為外來體)釋放到細胞外基質中。最近,對其他細胞(如抗原呈遞細胞)能夠分泌這種納米囊泡的發現激勵了對外來體的研究,提出的作用不同于最初描述于網織紅細胞成熟和分化中的作用。事實上,對不同類型細胞的幾個研究已表明外來體因在免疫應答期間在細胞之間傳遞信息而在免疫系統調節中起作用,因此,它代表細胞間通信的新途徑(I)。在這方面,已證實外來體在用兔弓形蟲(Toxoplasmagondii)進行的實驗性感染中的保護能力,兔弓形蟲是頂復(Apicomplexa)門的成員,拒原蟲也屬于頂復門(2)。此外,描述了以使用外來體作為人類預防劑或免疫刺激劑為基礎的幾種策略(3)。W09705900等公開了得自抗原呈遞細胞(如B細胞、巨噬細胞或樹突細胞)的外來體。該文件所述外來體的特殊性在干,因為它們得自抗原呈遞細胞,所以抗原存在于MHC-I和MHC-II環境中。文件EP1523990繼而描述了得自癌細胞的外來體(鑒定為texosome)或得自載有或未載有抗原的樹突細胞的外來體(該文件中將其稱為dexosome)。W02004014954使用不同的策略以得到在其表面顯示期望抗原的外來體,用基因組中包含期望抗原(muc-1)編碼序列的重組病毒轉染細胞系CT26(鼠結腸癌)和細胞系TA3HA (小鼠乳腺癌)的細胞,從而分離自該類細胞的外來體在表面上表達所述期望抗原。W00028001描述了得自基本上缺乏內源性MHC分子的肥大細胞的外來體。但是,該文件中描述的外來體確實在其表面上表達重組MHC。最后,W02008092153描述了得自癌細胞的外來體,其缺乏通常存在于外來體中的ー種或更多種免疫抑制多肽。基于使用分離自瘧原蟲感染鼠模型或對象的網織紅細胞的外來體,本專利技術人現已開發了防止和預防瘧疾的新策略。這些外來體得自瘧原蟲屬感染的外周血,或得自從所述外周血中預先得到的網織紅細胞的體外培養物。附圖簡述圖I:描述了分離自小鼠血漿的外來體的特征。(A)通過動態光散射進行的大小分析。(B)用2%多聚甲醛固定后的負染色。比例尺代表lOOnm。·圖2 : (A)分離自對照小鼠和約氏瘧原蟲(P. yoelii) 17X感染小鼠血液的網織紅細胞的吉姆薩染色。(B)來自網織紅細胞的外來體的負染色EM圖像。比例尺代表200nm。圖3 :描述了血液中的寄生蟲(parasitemia)隨時間的進展和用外來體免疫的小鼠的細胞向性(cell tropism)分析。由以下小鼠的平均值計算血液中的寄生蟲曲線2只未免疫對照小鼠、2只用分離自正常動物血液的外來體免疫的對照小鼠、3只用約氏瘧原蟲非致死株感染的動物的外來體免疫的小鼠,和3只用約氏瘧原蟲致死株感染的動物的外來體免疫的小鼠。在處死前一天對每組的代表動物的外周血涂片進行吉姆薩染色。圖4 :對用exC(n = 6)和exPyNL(n = 6)預先免疫的BALB/C小鼠組進行約氏瘧原蟲17XL感染的A)存活曲線和B)血液中的寄生蟲的時程。未免疫小鼠(η = 5)未經處理。圖5 :經外來體免疫的動物血清中抗約氏瘧原蟲的IgG抗體應答的Western印跡分析。在二次免疫后第20天通過上頜穿刺收集樣品。每張圖對應這些試驗中使用的每組動物的血衆混合物。在Western印跡中,使用得自約氏痕原蟲的非致死(AgNL)和致死(AgL)株的總抗原,通過使用與堿性磷酸酶綴合且針對小鼠IgG產生的山羊血清來檢測IgG抗體應答。圖6 :描述了來自用約氏瘧原蟲非致死株感染的小鼠血液的外來體免疫的動物中T、CD4+和CD8+細胞的細胞內染色分析。用5微克帶有CpG-ODN的PyNL外來體免疫Balb/c小鼠。初次免疫之后兩周,用5微克不帶有CpG-ODN的外來體進行加強免疫。(A)體外再刺激、細胞內染色以及流式細胞術分析之后計算⑶8+IFN-Y +的百分數。⑶顯示⑶4+IFN-Y +的CSFE1t5淋巴細胞的百分數,(C)顯示⑶4+IFN-Y+IL-2+的百分數。數據對應于ー個實驗,并且表示為3只未免疫小鼠和3只用非致死exPyNL株感染小鼠的外來體所免疫小鼠的平均值土標準誤差。圖7 :識別17XL-pRBC的免疫血清的明場和熒光圖像。NI =未免疫小鼠的血清;exC=用來自未感染小鼠REX的外來體免疫的小鼠血清;exPy I =用來自約氏瘧原蟲NL感染動物的REX免疫的兩只小鼠的血清。圖8 (A)-(D)進行外來體中存在的抗原的蛋白質組學分析的MS/MS譜,所述外來體源自約氏瘧原蟲感染小鼠和間日瘧原蟲感染患者的外周血。譜的生物信息學分析確定所分析的外來體樣品中約氏瘧原蟲和間日瘧原蟲兩種抗原的存在。圖9 :A) Vir多基因家族保守基序的示意圖。B) ViiJ太(Virpeptide)LPl (左)和ViiJ太LP2(右)的示意圖。附圖說明圖10 =Bioplex測定,表明來自巴西病區的ー些血清可以識別合成的長肽。圖11 :免疫熒光測定,表明抗Lpl㈧和抗Lp2(B)可以鑒定間日瘧原蟲天然感染的Vir蛋白。圖12 :包含Lpl和Lp2肽及其組合的免疫金標記人工外來體的圖像。所述外來體包含摩爾比為79 20 I的1,2_ニ油酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(D0PC)、膽固醇(CHOL) 和4-(對馬來酰亞胺苯基)丁酰磷脂酰基乙醇胺(MBP-PE)。用抗LPl和LP2Vir肽的抗體進行免疫標記,然后用蛋白A-金孵育,比例尺代表200nm。 專利技術詳述本專利技術的第一目的是分離自血漿/網織紅細胞培養物的外來體,所述外來體在其內部或表面包含至少ー種瘧原蟲屬抗原(下文稱為本專利技術的外來體)。本專利技術的外來體已顯示出抗瘧疾的致免疫能力,因此它們在制備防止和預防該疾病的疫苗中有很高的潛在可用性。存在于本專利技術外來體中的抗原可以來自于任何瘧原蟲物種。在本專利技術的ー個具體實施方案中,存在于外來本文檔來自技高網...

    【技術保護點】

    【技術特征摘要】
    【國外來華專利技術】2009.12.28 ES P2009312751.分離自網織紅細胞的外來體,其在內部或表面包含至少ー種瘧原蟲屬(Plasmodiumsp.)抗原。2.根據權利要求I所述的外來體,其中存在于所述外來體中的ー種或更多種所述抗原屬于間日癥原蟲(Plasmodium vivax)、惡性癥原蟲(Plasmodium falciparum)、三日癥原蟲(Plasmodium malariae)、卵形癥原蟲(Plasmodium ovale)、約氏癥原蟲(Plasmodiumyoelli)、P. achioitense、P. achromaticum、P. aegyptensis、P. aeuminatum、P. agamae、P. anasum、P. atheruri、P. azurophilum、P. balli、竹雞癥原蟲(P. bambusicolai)、P. basilisci、伯氏癥原蟲(P. berghei)、P. bigueti、巴西癥原蟲(P. bras i Iianum)、P. brygooi、P. booliati、狷玲癥原蟲(P. bubal is)、P. bucki、猴癥原蟲(P. coatneyi)、卡氏癥原蟲(P. cathemerium)、P. cephalophi、夏氏)E原蟲(P. chabaudi)、P. chiricahuae、P. circularis、P. cnemidophori、無原蟲(P. coatneyi)、Ρ· coggesnalli、P. colombiense、P. corradettii、鶴鵓癥原蟲(P. coturnix)、P. coulangesi、杜鹽癥原蟲(P. cuculus)、P. popo、P. cyclopsi、食蟹猴癥原蟲(P. cynomolgi)、P. diminutivum、P. diploglossi、狄氏癥原蟲(P. dissanaikei)、P. dominicana、硬膜癥原蟲(P. durae)、P. egerniae、P. elongatum、艾氏癥原蟲(P. eylesi)、P. fabesia、p. fairchildi、P. fallax、P. fieldi、P. foleyi、P. forresteri、P. floridense、脆癥原蟲(P. fragile)、甘漢氏癥原蟲(P. garnhami)、雞癥原蟲(P. gal Iinaceum)、P. giganteum、P. giovannolai、P. girardi、P. gonatodi、P. gonderi、P. georgesi、P. gracilis、格里菲斯癥原蟲(P. griff ithsi)、P. guanggong、丨メJ 德氏癥原蟲(P. gundersi)、P. guyannense、P. heischi、P. hegneri、P. hermani、P. heteronuc_Leare、7Kf(P. hexamerium)、P. holaspi、P. huffi、~bc胃癥原蟲(P. hylobati)、Ρ· icipeensis、P. inopinatum、豬尾猴癥原蟲(P. inui)、Ρ· jefferi、P. josephinae、聯核癥原蟲(P. juxtanucleare)、P. kempi、諾氏癥原蟲(P. knowlesi)、P. kentropyxi、P. leanucteus、P. lemuris、P. IophuraeΛP.lepidoptiformis、P. IygosomaeΛP. mabuiae、P. mackerrasae、P. maculilabre、P. maior、P. marginatum、 晨癥原蟲(P. matutinum)、墨西哥癥原蟲(P. mexicanumO、P. minasense、P. morulum、嗜核癥原蟲(P. nucleophilium)、P. octamerium、P. odocoilei、P. papernai、P. paranucleophilum、P. parvulum、P. pedioecetii、P. pelaezi、P. percygarnhami、P. petersi、P. pifanoi、P. pinotti、P. pinorrii、猿癥原蟲(P. pitheci)、P. pitmani、極癥原蟲(P. polare)、P. praecox、瑞氏癥原蟲(P. reichenowi)、殘癥原蟲(P. relictum)、P. rhadinurum、P. rhodaini、P. rooinsoni、萬氏拒原蟲(P. rouxiノ、P. sandosnami、P. sasai、P. scnweitzi、P. silvaticum、吼猴癥原蟲(P. simium)、半卵形癥原蟲(P. semiovale)、P. shortii、P. smirnovi、小號鳥癥原蟲(P. subpraecox)、細薄癥原蟲(P. tenue)、P. tejerai、銳齒蛇癥原蟲(P. tomodoni)、P. torrealbai、P. traguli、P. tribolonoti、P. tropiduri、P. uilenbergi、P. watteni、文氏癥原蟲(P. wenyoni)、Ρ· vacuolatum、P. vastator、P. vaughani、文可氏癥原蟲(P. vinckei)、P. volans、楊氏癥原蟲(P. youngi)。3.根據權利要求2所述的外來體,其中存在于所述外來體中的一種或更多種所述抗原屬于間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、約氏瘧原蟲、伯氏瘧原蟲、巴西瘧原蟲、夏氏瘧原蟲、食蟹猴瘧原蟲、脆瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、瑞氏瘧原蟲。4.根據前述權利要求中任一項所述的外來體,其中所述外來體分離自猴、小鼠和/或人的網織紅細胞。5.根據前述權利要求中任一項所述的外來體,其用于防止和預...

    【專利技術屬性】
    技術研發人員:埃爾南多·安東尼奧·德爾波蒂略奧萬多洛雷娜·馬丁豪拉爾瑪利亞·卡門·費爾南德斯貝塞拉
    申請(專利權)人:巴塞羅那國際健康研究中心加泰羅尼亞高等研究院塞萊克斯基金會巴塞羅那省立醫院診所
    類型:
    國別省市:

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