用于試樣的圖像顯示方法及其光學(xué)顯微設(shè)備技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)描述了一種用于試樣(16)圖像顯示的方法和設(shè)備。通過(guò)借助于成像光學(xué)系統(tǒng)(40)使樣試(16)在圖像傳感器(28)上成像，而攝取單一圖像序列。為了每個(gè)單一圖像的攝取均對(duì)試樣(16)提供了標(biāo)記物結(jié)構(gòu)，在所述標(biāo)記物結(jié)構(gòu)中，單一標(biāo)記物借助于成像光學(xué)系統(tǒng)(40)以空間可相互分開(kāi)的光分布(82)的形式在圖像傳感器(28)上成像。確定所述光分布(82)的重心位置(84、86、88)，并重疊成該試樣(16)的全圖。按本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)，在攝取單一圖像序列期間測(cè)量引起圖像偏移的溫度數(shù)值(△T1、△T2、…,△Tn)。按預(yù)定的分配數(shù)據(jù)(400)將取決于溫度的偏移數(shù)值(△X1、△X2、…,△Xn；△Y1、△Y2、…,△Yn)分配給引起圖像偏移的溫度數(shù)值(△T1、△T2、…,△Tn)。按偏移數(shù)值(△X1、△X2、…,△Xn；△Y1、△Y2、…,△Yn)校正所確定的重心位置(84、86、88)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
用于試樣的圖像顯示方法及其光學(xué)顯微設(shè)備
本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種應(yīng)用權(quán)利要求1的前序部分的光學(xué)顯微設(shè)備以進(jìn)行試樣圖像顯示的方法。本專(zhuān)利技術(shù)還涉及一種根據(jù)權(quán)利要求9的前序部分的光學(xué)顯微鏡設(shè)備。
技術(shù)介紹
近來(lái)研發(fā)了光學(xué)顯微成像方法，通過(guò)所述方法，試樣能夠基于單一標(biāo)記物，特別是熒光分子的有序的、隨機(jī)的定位而被顯示，所述試樣比常規(guī)的光學(xué)顯微鏡的基于衍射的分辨極限更小。例如在文獻(xiàn)WO2006/127692A2；DE102006021317B3；WO2007/12843A1；US2009/0134342A1；DE102008024568A1；“Sub-diffraction-limitimagingbystochasticopticalreconstructionmicroscope(STORM)”，NatureMethods3,793-796(2006)，M.J.Rust,M.Bates,X.Zhuang；“ResolutionofLambda/10influorescencemicroscopyusingfastsinglemoleculephoto-switching”，GeislerC.etal,Appl,Phys.A,88,223-226(2007)中描述了這類(lèi)方法。這種新的顯微術(shù)分支也稱(chēng)為定位顯微術(shù)。在文獻(xiàn)中，所述應(yīng)用的方法以如下標(biāo)記被公開(kāi)，例如：(F)PALM((Fluorescence)PhotoactivationLocalizationMicroscopy（熒光）光敏定位顯微鏡),PALMIRA(PALMwithIndependentlyRunningAcquisition具獨(dú)立運(yùn)行采集器的PALM),GSD(IM)(GroundStateDepletionIndividualMoleculereturn)Microscopy基態(tài)損耗（單分子返回）顯微鏡)或(F)STORM((Fluorescence)StochasticOpticalReconstructionMicroscopy（熒光）隨機(jī)光重建顯微鏡)。這類(lèi)新方法的共同點(diǎn)在于利用標(biāo)記物處理待成像的試樣，所述標(biāo)記物具有兩種狀態(tài)，即“亮”態(tài)和“暗”態(tài)。例如當(dāng)使用熒光染料作為標(biāo)記物時(shí)，則亮態(tài)是能發(fā)熒光的狀態(tài)，而暗態(tài)是不能發(fā)熒光的狀態(tài)。為了以比成像光學(xué)系統(tǒng)的常規(guī)分辨極限更高的分辨率對(duì)試樣進(jìn)行成像，就要使小部分量的標(biāo)記物重復(fù)轉(zhuǎn)變成亮態(tài)。該“活性”的部分量形成標(biāo)記物結(jié)構(gòu)，其各個(gè)轉(zhuǎn)變成亮態(tài)的標(biāo)記物相互之間的平均間距大于成像光學(xué)系統(tǒng)的分辨極限。該各標(biāo)記物結(jié)構(gòu)在空間分辨圖像傳感器上成像，該圖像傳感器以檢測(cè)在空間上相互可分開(kāi)的光分布的形式來(lái)檢測(cè)該各標(biāo)記物。以此方法攝取大量單一圖像，在這些單一圖像中總是成像有另一種標(biāo)記物結(jié)構(gòu)。在圖像分析過(guò)程中由此確定每個(gè)單一圖像中所述光分布的重心位置，該重心位置顯示了處于亮態(tài)的標(biāo)記物。將由原始數(shù)據(jù)-單一圖像測(cè)算出的光分布的重心位置以全圖形式匯總到總圖示中。通過(guò)該總圖示產(chǎn)生的高分辨率的全圖反映出標(biāo)記物的分布。為了有代表性地重現(xiàn)該待測(cè)試樣，必須探測(cè)到足夠多的標(biāo)記物信號(hào)。但是，因?yàn)樵诟骰钚詷?biāo)記物結(jié)構(gòu)中標(biāo)記物的數(shù)目被處于亮態(tài)的兩標(biāo)記物相互間所必需的最小平均間距所限，所以需攝取非常多的單一圖像，以使該試樣充分成像。通常單一圖像的數(shù)目為10000-100000。攝取單一圖像所需的時(shí)間的下限被該圖像傳感器的最大圖像攝取速率所限。這導(dǎo)致了用于總圖示所需的單一圖像序列的總攝取時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。因此所述總攝取時(shí)間可達(dá)數(shù)小時(shí)。在這樣長(zhǎng)的總攝取時(shí)間內(nèi)，會(huì)產(chǎn)生導(dǎo)致待成像試樣相對(duì)于成像光學(xué)系統(tǒng)發(fā)生偏移的熱效應(yīng)，例如光顯微鏡機(jī)械部件的熱膨脹、收縮或應(yīng)變。由于為了完成高分辨率的全圖而按重心規(guī)定匯總所有的單一圖像，所以在攝取兩個(gè)相繼的單一圖像時(shí)出現(xiàn)的試樣和成像光學(xué)系統(tǒng)之間的所有相對(duì)移動(dòng)均惡化該全圖的位置分辨率。上述的問(wèn)題可在下面按附圖1至4闡明。圖1示出常規(guī)的倒置光學(xué)顯微鏡10的簡(jiǎn)圖。該倒置光學(xué)顯微鏡10具有支架12，其上安置有載物臺(tái)14。在載物臺(tái)14上安置試樣固定件15，待成像的試樣16布置在所述試樣固定件上。該試樣16由配置在載物臺(tái)14上方的光源17照射。所述光源17安裝在旋轉(zhuǎn)臂18上。在該旋轉(zhuǎn)臂18上還安置有固定件20，所述固定件包括多種在圖1中未示出的光學(xué)系統(tǒng)，該光學(xué)系統(tǒng)用于實(shí)現(xiàn)不同的照射模式，例如標(biāo)準(zhǔn)的透射光照射或相對(duì)比照射。為此，將在該固定件20中為各個(gè)照射模式提供的光學(xué)系統(tǒng)轉(zhuǎn)擺至圖1中用22表示的照射光徑中。由光源17提供的照射光經(jīng)安裝在該固定件20背面的聚光鏡23導(dǎo)向試樣16。為便于對(duì)試樣16的操作，所述旋轉(zhuǎn)臂18可與上面提及的光學(xué)系統(tǒng)一起從載物臺(tái)14上脫開(kāi)。在載物臺(tái)14下方設(shè)置有電動(dòng)的物鏡旋轉(zhuǎn)臺(tái)24，所述物鏡旋轉(zhuǎn)臺(tái)上安裝有多個(gè)物鏡26。所述物鏡26能夠通過(guò)物鏡旋轉(zhuǎn)臺(tái)24圍繞圖1中用O表示的光軸O的旋轉(zhuǎn)，選擇性地轉(zhuǎn)擺到通過(guò)光軸O確定的成像光徑中。所述恰好轉(zhuǎn)擺到成像光徑中的物鏡26通過(guò)在載物臺(tái)14中形成的貫通到圖像傳感器28上的通孔19使試樣16成像。所述圖像傳感器28與控制圖像傳感器28的傳感器驅(qū)動(dòng)器29相連，此外，該傳感器驅(qū)動(dòng)器29將通過(guò)圖像傳感器28接收的傳感器信號(hào)生成為用于進(jìn)一步圖像處理的圖像信號(hào)。所述顯微鏡支架12與控制設(shè)備30如電子計(jì)算機(jī)相連接，通過(guò)所述控制設(shè)備能夠?qū)︼@微鏡功能和尤其是圖像處理進(jìn)行控制。對(duì)此所述控制設(shè)備30接收由傳感器驅(qū)動(dòng)器29生成的圖像信號(hào)。所述控制設(shè)備30與監(jiān)視器32相連，在所述監(jiān)視器上顯示出根據(jù)處理后的圖像信號(hào)所生成的試樣圖像。該試樣圖像還可經(jīng)目鏡34觀察。在圖1的光學(xué)顯微鏡10中，物鏡旋轉(zhuǎn)臺(tái)24安裝在U-形支架12上，以致在成像物鏡26和試樣16之間的圖像偏移相關(guān)距離(image-drift-relevantdistance)是相對(duì)較大的。這樣，所述試樣16通過(guò)試樣固定件15、載物臺(tái)14、U-形支架12和物鏡旋轉(zhuǎn)臺(tái)24與物鏡26相連。由于該較大的距離，圖1的光學(xué)顯微鏡10特別易于受熱不穩(wěn)定性的影響，所述熱不穩(wěn)定性似乎隨所述距離而增加。這種熱不穩(wěn)定性能夠由環(huán)境空氣中或光學(xué)顯微鏡10本身的溫度波動(dòng)引起的，或許由受熱的電子構(gòu)件引起。所述溫度波動(dòng)導(dǎo)致例如由金屬制成的、使試樣16和物鏡26保持定位的構(gòu)件通過(guò)熱膨脹或收縮而改變其尺寸，由此可導(dǎo)致試樣16和物鏡26的相對(duì)移動(dòng)。以下的測(cè)評(píng)表明，這種熱不穩(wěn)定性在所達(dá)到的分辨率通常低于20nm的高分辨率定位顯微術(shù)領(lǐng)域中是如何重要。鋁作為通常在制造金屬的顯微鏡構(gòu)件中所使用的材料，其熱膨脹系數(shù)為23·10-6K-1。如果示例性地假定，在圖1所示的光顯微鏡10中，試樣16與物鏡26相連的圖像偏移相關(guān)距離為10cm，且該距離由鋁制成的顯微鏡構(gòu)件確定，則每K溫度變化產(chǎn)生的機(jī)械偏移約為2.3μm。如果將該溫度變化與上述的空間分辨率相關(guān)聯(lián)，則直接顯示出，溫度波動(dòng)可大大損害成像質(zhì)量。對(duì)于圖1所示的光顯微鏡10，例如在由電子構(gòu)件構(gòu)成的傳感器驅(qū)動(dòng)器29中存在可引起偏移的熱源，該熱源使支架12受熱。同樣這也適用于例如用于旋轉(zhuǎn)物鏡旋轉(zhuǎn)臺(tái)24的電動(dòng)構(gòu)件。此外，光源17以及存在于固定件20中的許多機(jī)械執(zhí)行元件也產(chǎn)生熱，所述熱對(duì)成像準(zhǔn)確性也是有害的。為避免由熱引起的偏移，在文獻(xiàn)WO2004/034124A1本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種應(yīng)用光學(xué)顯微設(shè)備(100)以用于試樣(16)圖像顯示的方法，所述光學(xué)顯微設(shè)備包括成像光學(xué)系統(tǒng)(40)和圖像傳感器(28)，所述方法包括下列步驟：通過(guò)借助于成像光學(xué)系統(tǒng)(40)對(duì)試樣(16)的連續(xù)成像，在圖像傳感器(28)上攝取單一圖像的序列，其中對(duì)每個(gè)單一圖像的攝取均為試樣(16)提供標(biāo)記物結(jié)構(gòu)，在所述標(biāo)記物結(jié)構(gòu)中，各標(biāo)記物可借助于成像光學(xué)系統(tǒng)(40)以空間上可相互分開(kāi)的光分布(82)形式在圖像傳感器(28)上成像，確定該光分布(82)的重心位置(84、86、88)，所述重心位置在各單一圖像中顯示所成像的標(biāo)記物，和將確定的重心位置(84、86、88)重疊成試樣(16)的全圖，其特征在于，在攝取單一圖像序列期間測(cè)量引起圖像偏移的溫度數(shù)值(△T1、△T2、…,△Tn)，按預(yù)定的分配數(shù)據(jù)(400)將溫度相關(guān)的偏移數(shù)值(△X1、△X2、…,△Xn；△Y1、△Y2、…,△Yn)分配給引起圖像偏移的溫度數(shù)值(△T1、△T2、…,△Tn)，并且按偏移數(shù)值(△X1、△X2、…,△Xn；△Y1、△Y2、…,△Yn)校正所確定的重心位置(84、86、88)。

【技術(shù)特征摘要】
2011.06.22 DE 102011051278.01.一種應(yīng)用光學(xué)顯微設(shè)備(100)以用于試樣(16)圖像顯示的方法，所述光學(xué)顯微設(shè)備包括成像光學(xué)系統(tǒng)(40)和圖像傳感器(28)，所述方法包括下列步驟：通過(guò)借助于成像光學(xué)系統(tǒng)(40)對(duì)試樣(16)的連續(xù)成像，在圖像傳感器(28)上攝取單一圖像的序列，其中對(duì)每個(gè)單一圖像的攝取均為試樣(16)提供標(biāo)記物結(jié)構(gòu)，在所述標(biāo)記物結(jié)構(gòu)中，各標(biāo)記物可借助于成像光學(xué)系統(tǒng)(40)以空間上可相互分開(kāi)的光分布(82)形式在圖像傳感器(28)上成像，確定該光分布(82)的重心位置(84、86、88)，所述重心位置在各單一圖像中顯示所成像的標(biāo)記物，和將確定的重心位置(84、86、88)重疊成試樣(16)的全圖，其特征在于，在攝取單一圖像序列期間測(cè)量引起圖像偏移的溫度數(shù)值(△T1、△T2、…,△Tn)，按預(yù)定的分配數(shù)據(jù)(400)將溫度相關(guān)的偏移數(shù)值(△X1、△X2、…,△Xn；△Y1、△Y2、…,△Yn)分配給引起圖像偏移的溫度數(shù)值(△T1、△T2、…,△Tn)，按偏移數(shù)值(△X1、△X2、…,△Xn；△Y1、△Y2、…,△Yn)校正所確定的重心位置(84、86、88)，并且在攝取代表單一圖像序列的原始數(shù)據(jù)之后根據(jù)校正的重心位置形成試樣的無(wú)偏移的完整定位顯微圖像。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，由實(shí)驗(yàn)確定所述分配數(shù)據(jù)(400)，并存儲(chǔ)在光學(xué)顯微設(shè)備(100)中。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，提供具有至少一個(gè)參比標(biāo)記物的參比結(jié)構(gòu)，用于確定分配數(shù)據(jù)(400)，將引起圖像偏移的溫度數(shù)值設(shè)置為多個(gè)參比溫度值，為每個(gè)參比溫度值攝取該參比結(jié)構(gòu)的參比單一圖像，其中，借助于成像光學(xué)系統(tǒng)以參比光分布形式使該參比結(jié)構(gòu)的參比標(biāo)記物在圖像傳感器上成像，為每個(gè)參比溫度值確定其所屬的參比光分布的參比重心位置，由參比重心位置依賴(lài)于參比溫度值的變比來(lái)確定與溫度相關(guān)的偏移數(shù)值。4.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于，測(cè)量該光學(xué)顯微設(shè)備(100)的至少一個(gè)構(gòu)件(12、14、42)的溫度作為引起圖像偏移的溫度數(shù)值(△T1、△T2、…、△Tn)。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，對(duì)在載物臺(tái)(14)內(nèi)部或其表面上的溫度，和/或在為成像光學(xué)透鏡(40)提供的固定件設(shè)備(42)內(nèi)部或其表面上的溫度，和/或在其上放置載物臺(tái)(14)的支架(12)內(nèi)部或其表面上的溫度進(jìn)行測(cè)量。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，將該測(cè)得的溫度數(shù)值(△T1、△T2、…,△Tn)轉(zhuǎn)換成惰性補(bǔ)償值，并按轉(zhuǎn)換過(guò)的溫度數(shù)值確定偏移數(shù)值(△X1、△X2、…,△Xn；△Y1、△Y2、…,△Yn...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：J·弗林格，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：徠卡顯微系統(tǒng)復(fù)合顯微鏡有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：