本發明專利技術公開了一種γ-氨基丁酸轉運蛋白及其編碼基因與應用。本發明專利技術提供了一種蛋白，名稱為GabP，其編碼基因為GabP，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；（b）將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與轉運γ-氨基丁酸相關的由序列2衍生的蛋白質。本發明專利技術的實驗證明，本發明專利技術發現了一個新基因，該基因編碼的蛋白可以用來轉運γ-氨基丁酸。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
，尤其涉及一種Y-氨基丁酸轉運蛋白及其編碼基因與應用。
技術介紹
Y -氨基丁酸是一種非蛋白質氨基酸，是中樞神經系統的神經遞質，具有重要的生理活性。Y-氨基丁酸可以降低神經元活性、降血壓、抗焦慮、改善睡眠、調節激素分泌。Y-氨基丁酸作為一種新型功能性因子，已經廣泛應用于食品、醫療等領域。已經報道在有些細菌中存在Y-氨基丁酸轉運蛋白。例如在大腸桿菌中Y-氨基丁酸轉運蛋白基因位于與Y-氨基丁酸代謝相關的基因簇中。而在枯草芽孢桿菌中Y-氨·基丁酸轉運蛋白基因與Y-氨基丁酸代謝相關的基因并不相鄰。大腸桿菌的Y-氨基丁酸轉運蛋白與枯草芽孢桿菌的Y-氨基丁酸轉運蛋白屬于氨基酸一多聚胺一有機金屬離子(amino acid-polyamine-organocation)超家族(APC Superfamily)。在棒桿菌屬細菌中還沒有報道有Y-氨基丁酸轉運蛋白存在。轉運系統在細胞代謝過程中起關鍵作用，營養物質的攝取，代謝物的分泌，能量和信息的交換都與轉運系統密切相關。氨基酸轉運系統普遍存在于真核和原核細胞。細胞可以利用氨基酸內運系統從環境中攝入可利用的氨基酸，而直接用于蛋白質或肽的合成，或通過分解代謝為細胞提供碳源、氮源或能源。氨基酸外運系統在產物分泌過程中起重要作用。氨基酸轉運系統除了其生理上的重要性以外，在氨基酸生產方面也是十分重要的。多種氨基酸都可以通過微生物發酵法生產。氨基酸外運系統在產物分泌中起重要作用，而氨基酸內運系統會使已分泌的產物重新被細胞攝入，造成代謝能量的浪費，對細胞內代謝途徑上的關鍵酶產生抑制，阻礙產物的進一步合成，并使氨基酸生產速率降低。迄今為止，已報道了在氨基酸發酵工業中，為提高氨基酸產量，使用與氨基酸轉運有關的基因，例如發生突變的大腸桿菌蘇氨酸轉運系統提高蘇氨酸產量以及發生突變的棒桿菌色氨酸轉運系統可以提高色氨酸產量。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供一種Y-氨基丁酸轉運蛋白及其編碼基因。本專利技術提供的蛋白，轉運蛋白名稱為GabP,其編碼基因命名為GabP,是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與轉運Y-氨基丁酸相關的由序列2衍生的蛋白質。其中，序列表中的序列2由415個氨基酸殘基組成。上述蛋白中，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。編碼上述蛋白的基因也是本專利技術保護的范圍。上述基因是如下(I)或(2)或(3)的DNA分子(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼轉運Y-氨基丁酸相關蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼轉運Y-氨基丁酸相關蛋白的DNA分子。其編碼基因的讀碼框序列I由1248個核苷酸組成。上述基因中的嚴格條件具體可以為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用 2 X SSC, O. 1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。含有上述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本專利技術保護的范圍。在本專利技術的實施例中，上述重組載體為將上述蛋白的編碼基因插入pXMJ19載體的XbaI和EcoRI酶切位點間，得到表達上述蛋白的重組載體。擴增上述基因全長或其任意片段的引物對也是本專利技術保護的范圍。上述蛋白、上述基因或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在轉運Y-氨基丁酸中的應用也是本專利技術保護的范圍。本專利技術的第二個目的是提供一種重組菌A。本專利技術提供的重組菌A，為抑制目的菌中上述蛋白的表達或活性得到的重組菌。上述重組菌A中的目的菌為原核細菌，所述原核細菌具體為谷氨酸棒桿菌；在本專利技術的實施例中具體為谷氨酸棒桿菌RES167。上述抑制目的菌中上述蛋白的表達或活性為沉默或缺失目的菌中上述蛋白的編碼基因導致抑制上述蛋白的表達或活性。上述重組菌A中，所述抑制目的菌中上述蛋白的表達或活性通過同源重組實現。上述的同源重組的方法具體為將DNA分子導入目的菌；所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列3。在上述同源重組的方法中，將DNA分子導入目的菌為通過重組載體A導入目的菌；所述重組載體A為將所述DNA分子插入pK18mobsacB的多克隆位點間得到的載體,具體為將上述DNA分子插入pK18mobsacB的SphI和SmaI酶切位點間得到的載體。本專利技術的第三個目的是提供一種重組菌B。本專利技術提供的重組菌B，為將谷氨酸脫羧酶編碼基因導入上述的重組菌A中得到的重組菌；其中，所述谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列具體為序列表中的序列5 ;所述谷氨酸脫羧酶的編碼基因的核苷酸序列具體為序列表中的序列4或序列表中的序列4自5’末端第24-1430位核苷酸。上述重組菌B中，所述谷氨酸脫羧酶編碼基因通過重組載體B導入上述的重組菌A中；所述重組載體B具體為將所述谷氨酸脫羧酶編碼基因插入表達載體pXMJ19中，得到表達谷氨酸脫羧酶的載體；在本專利技術的實施例中重組載體B為將序列表中序列4插入pXMJ19的HindIII和XbaI酶切位點間得到的載體。上述的重組菌B在制備Y-氨基丁酸中的應用也是本專利技術保護的范圍。本專利技術的第四個目的是提供一種制備Y-氨基丁酸的方法。本專利技術提供了一種制備Y -氨基丁酸的方法，為將上述的重組菌B在含有L-谷氨酸的培養基進行轉化反應，收集上清液，得到Y -氨基丁酸。上述收集上清液采用離心方式。 上述轉化反應的條件為30°C反應I小時。上述含有L-谷氨酸的培養基為含有L-谷氨酸的麗II培養基；在上述方法中，在轉化反應前，還包括將重組菌B接入LB培養基中培養的步驟。本專利技術的第五個目的是提供一種DNA分子、含有所述DNA分子的重組載體A、表達盒、轉基因細胞系或重組菌或重組載體B。本專利技術提供的DNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列3。本專利技術提供的重組載體A具體為將所述DNA分子插入pK18mobsacB的多克隆位點間得到的載體；具體為將上述DNA分子插入pK18mobSaCB的SphI和SmaI酶切位點間得到的載體。本專利技術提供的重組載體B，為將谷氨酸脫羧酶編碼基因插入表達載體PXMJ19中，得到表達谷氨酸脫羧酶的載體，具體為將序列表中序列4插入pXMJ19的HindIII和XbaI酶切位點間得到的載體；所述谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列具體為序列表中的序列5 ;所述谷氨酸脫羧酶的編碼基因的核苷酸酸序列具體為序列表中的序列4或序列表中的序列4自5’末端第24-1430位核苷酸。本專利技術的實驗證明，本專利技術在谷氨酸棒桿菌RES167 (C. glutamicum)中發現了一個新基因，其編碼的蛋白具有轉運Y-氨基丁酸的功能，將該基因缺失部分片段，則表達的蛋白不具有轉運Y-氨基丁酸的功能，說明該基因的確和轉運Y-氨基丁酸有關，該蛋白為轉運Y-氨基丁酸的蛋白。將谷氨酸棒桿菌RES167中的該蛋白編碼基因缺失后，再導入谷氨酸脫羧酶，得到重組菌，利本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；（b）將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與轉運γ？氨基丁酸相關的由序列2衍生的蛋白質。
【技術特征摘要】
2011.11.21 CN 201110370676.61.一種蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與轉運Y-氨基丁酸相關的由序列2衍生的蛋白質。2.編碼權利要求I所述蛋白的基因； 所述基因具體是如下(I)或(2)或(3)的DNA分子 (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼轉運Y-氨基丁酸相關蛋白的DNA分子; (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼轉運Y-氨基丁酸相關蛋白的DNA分子。3.含有權利要求2所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌； 或擴增權利要求2所述基因全長或其任意片段的引物對。4.權利要求I所述蛋白、權利要求2所述基因或權利要求3所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在轉運Y-氨基丁酸中的應用。5.一種重組菌A，為抑制目的菌中權利要求I所述蛋白的表達或活性得到的重組菌；所述目的菌具體為原核細菌，所述原核細菌進一步具體為谷氨酸棒桿菌；所述谷氨酸棒桿菌進一步具體為谷氨酸棒桿菌RES167。6.根據權利要求5所述的重組菌A，其特征在于 所述抑制目的菌中權利要求I所述蛋白的表達或活性通過同源重組實現； 所述同源重組的方...
【專利技術屬性】
技術研發人員：丁久元，趙智，劉雙江，馬溫華，
申請(專利權)人：中國科學院微生物研究所，
類型：發明
國別省市：
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