本發(fā)明專利技術(shù)實施例公開了一種基于目標(biāo)誘導(dǎo)鏈釋放和限制性內(nèi)切酶酶切循環(huán)的新型信號放大技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測赭曲霉素A的方法。將赭曲霉素A適體(DNA1)和赭曲霉素A適體互補序列(DNA2)固定于磁珠表面，在赭曲霉素A存在時，DNA1與赭曲霉素A作用，導(dǎo)致DNA2從磁珠表面脫落；經(jīng)過磁性分離后，將DNA2與聚合模板DNA3雜交，形成部分互補DNA雙鏈，在DNA聚合酶Phi29的作用下，DNA2沿著模板DNA3生長，從而形成完全互補的雙鏈DNA；生成的雙鏈DNA的一條鏈被限制性內(nèi)切酶Nb.BbvCI切割，從而生成一條短鏈DNA；被切割的DNA形成一個新的生長點，并在聚合酶Phi29和限制性內(nèi)切酶Nb.BbvC的作用下，繼續(xù)進行生長和切割，由于生長和切割的不斷進行，從而產(chǎn)生大量的短鏈DNA；再利用DNA和化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光納米粒子為探針對該短鏈DNA進行測定，實現(xiàn)赭曲霉素A的測定。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于化學(xué)發(fā)光檢測
，特別涉及一種信號放大技術(shù)的研制和一種化學(xué)發(fā)光探針的制備，在其應(yīng)用上涉及赭曲霉素A(Ochratoxin A, 0ΤΑ)含量的檢測。
技術(shù)介紹
根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計報告表明，食源性疾病已經(jīng)成為當(dāng)今世界上分布最廣泛、最常見的疾病之一。食源性相關(guān)疾病的發(fā)病率居各類疾病總發(fā)病率的前列，并成為當(dāng)前國際上最突出的公共衛(wèi)生問題。造成食源性相關(guān)疾病的食品安全問題主要集中在生物毒素危害、化學(xué)危害、食品微生物危害、寄生蟲危害等幾個方面。在糧食供應(yīng)中，毒素可由許多途徑產(chǎn)生，如農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、工業(yè)加工以及儲藏運輸活動等；這些有害物質(zhì)在ng/g pg/g、甚至更低的水平上對人類的身體有害。食品中霉菌毒素污染是一個特殊問題，這是由于 真菌感染的谷物豆類、水果干、花生、啤酒和葡萄汁等加工后還會存在于食品中。每年都有很多人由于食品中有害物質(zhì)而感染疾病 0例如，最常見的疾病胃腸炎，其就是由于攝入受金黃色葡萄球菌腸毒素(SEs)污染的食物所引起的。赭曲霉毒素A是天然存在的霉菌衍生代謝產(chǎn)生的一種真菌毒素，能使人的腎臟受損、動物的產(chǎn)蛋率下降，并有致畸、致癌作用，而且赭曲霉毒素A還可通過母親的血液轉(zhuǎn)入到乳汁中嬰兒攝取。因此，很多國家都對食品中的OTA含量都有限制。OTA檢測技術(shù)已經(jīng)得到長足的發(fā)展?，F(xiàn)在OTA檢測方法主要是色譜技術(shù)，包括薄層色譜(TLC)，氣相色譜(GC)，高效液相色譜(HPLC)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)，固相萃取-液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(SPE-LC-ESI-MS)，毛細管電泳法(CE)等。此外，固相微萃取-液相色譜-熒光檢測也已經(jīng)報道過了。自從Cruz-Aguado和Penner在2008年發(fā)現(xiàn)了具有選擇性識別OTA的DNA適體后，科研人員相繼研究出了一系列基于OTA適體的檢測OTA的新方法。這開辟了一種 OTA 真菌毒素檢測的新局面。盡管這些OTA檢測方法自身有很多優(yōu)勢，但仍然需要尋找一些新方法來提高測定的靈敏度和選擇性。提高生物傳感器靈敏度的有效方法之一就是建立新的信號放大技術(shù)。一些信號放大技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，滾環(huán)放大(RCA)，環(huán)介導(dǎo)等溫放大(LAMP)和限制性內(nèi)切酶信號放大都已經(jīng)見諸報道了。在這些方法中，限制性內(nèi)切酶信號放大方法是借助切口酶為工具，以循環(huán)利用為原理，使一個待測目標(biāo)物產(chǎn)生多個信號單元。這種切口酶的酶切循環(huán)信號放大技術(shù)在分析檢測中取得了高的靈敏度，開辟了新的信號放大原理和分析測定技術(shù)，這種方法測定的靈敏度較普通方法(沒有經(jīng)過切口酶的酶切循環(huán)信號放大過程)提高了許多。本專利技術(shù)的目的是利用DNA聚合酶聚合作用和切口酶酶切作用原理構(gòu)建以一個目標(biāo)待測物產(chǎn)生多個信號單元的信號放大技術(shù)，以功能化的納米粒子為標(biāo)記物，實現(xiàn)高靈敏度對OTA行進測定。本專利技術(shù)所提供的方法包括以下步驟(I)制備功能化的納米粒子。所述的方法，其所述的納米粒子為表面具有活性基團的二氧化硅納米粒子、金納 米粒子、磁性納米粒子、量子點、聚合物納米粒子、脂質(zhì)體以及沒有活性基團的金納米粒子。(2)利用化學(xué)發(fā)光試劑對功能化的納米粒子進行修飾，制備化學(xué)發(fā)光納米粒子。所述的方法，其所述的化學(xué)發(fā)光試劑為魯米諾、魯米諾衍生物；光澤精、洛粉堿、過氧化草酸酯類以及吖啶酯類及其衍生物。(3)利用識別作用DNA5對化學(xué)發(fā)光納米粒子進行修飾，得化學(xué)發(fā)光納米粒子探針。(4)利用適體DNAl和互補DNA2對磁性微珠進行修飾制備功能化的磁性微珠(FMBl)。(5)利用DNA4對磁性微珠進行修飾制備另外一種用于捕獲后續(xù)DNA的功能化的磁性微珠FMB2。(6)利用OTA與適體DNAl的作用，將(4)中制備的功能化磁性微珠表面的DNA2置換下來，釋放DNA2 ;將釋放出的DNA2與模板DNA3反應(yīng)，生成部分互補的雙鏈，在DNA聚合酶和切割酶的作用下，實現(xiàn)生長于切割的循環(huán)，生成大量的短鏈DNA。(7)所述的方法，其所述的對短鏈DNA產(chǎn)生作用的酶為聚合酶Phi29，進行切割的酶為限制性內(nèi)切酶Nb. BbvCI。(8)以化學(xué)發(fā)光納米粒子為探針，利用功能化磁性微珠表面DNA3捕獲作用連接(6)生成的短鏈DNA，引起功能化磁性微珠表面化學(xué)發(fā)光試劑濃度的變化。(9)化學(xué)發(fā)光檢測。將(8)中捕獲有化學(xué)發(fā)光探針的磁性微珠進行化學(xué)發(fā)光測定，據(jù)此實現(xiàn)對OTA的檢測。附圖說明圖I為本專利技術(shù)的實驗原理示意圖。圖2不同目標(biāo)物的檢測結(jié)果圖。圖3為化學(xué)發(fā)光強度與OTA濃度的標(biāo)準曲線圖。具體實施例方式下面的實例將具體說明本專利技術(shù)的操作方法，但本專利技術(shù)的實施方法不限于此。I本專利技術(shù)所用的試劑4-氧-4-氨基]-2-丁酸(OTSPAB)從上海信達化學(xué)工業(yè)有限公司(上海，中國)購進。四乙氧基硅烷(TEOS)，正己醇，曲拉通X-100 (TX-100)和環(huán)己烷都是從上海化工廠購進(上海，中國)。N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和I-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)是從Sigma (St. Louis, USA)購進的。N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾(ABEI)是從 Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. (Tokyo, Japan)買進的。DNA聚合酶Phi29(10Ul·! L—1)(包含Phi29聚合酶反應(yīng)緩沖溶液)和三磷酸脫氧單核苷酸混合溶液(dNTPs) (IOmM)和 Nb. BbvCI (10U μ Γ1)(包含緩沖液 2)都是從 New England BiolabsCo. Ltd. (Ipswich,MA, USA)買進。OTA 是從 Sigma-Aldrich (USA)購進。(注意:0ΤΑ 是一種具有很強的致癌作用的藥品，因此特別注意的是盡量避免與它接觸。受污染的OTA原料，赭曲霉毒素和法華林必須妥善處理。)輕基化磁性微珠(MBl) (I μ m-1. 5 μ m, IOmg ml/1)和輕基化磁性微珠(MB2) (100-200nm, 5mg mL—1)是從天津貝思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心買進的(天津，中國)。所有的試劑都是分析純并且使用前不需要進一步進行純化。結(jié)合緩沖液(BB)(IOmM Tris, pH8. 5,120mM NaCl，5mM KCl，和 20mM CaCl2)用于在適體和 OTA 之間的結(jié)合反應(yīng)。2本專利技術(shù)所用的DNA由賽百盛基因技術(shù)有限公司(北京，中國)合成，序列如下 2. I DNAl 5/ -NH2-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3'2. 2 DNA2 5/ -CAC CCA CAC CCG ATC-3'2. 3 DNA3 5'-ACT CCC CGG ATT CCTCAGC GAT CGG GTG TGG GTG-3'2.4 DNA4 :5'-NH2_AAC TTA ACT CCC CGG-3'2. 5 DNA5 :5'-ATT CCT CAG AGG TAC-3'。3化學(xué)發(fā)光納米粒子探針的制備3. I功能化二氧化硅納米粒子的合成。將I. 77mL表面活性劑TX-100，7. 5mL環(huán)己燒和I. 8mL助表面活性劑正己醇用磁力攪拌器混合30min.。然后，加入0. 48mL水，并持續(xù)攪拌至混合物形成均勻的油包本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
基于目標(biāo)誘導(dǎo)鏈釋放和限制性內(nèi)切酶酶切循環(huán)的信號放大技術(shù)建立及其在赭曲霉素A超靈敏度檢測中的應(yīng)用，其特征包括以下步驟：(a)首先，將適體和適體互補序列固定在磁珠表面，在有目標(biāo)物存在時，適體互補序列從磁珠表面脫落。經(jīng)磁性分離后，將適體互補序列與模版DNA雜交，在DNA聚合酶的作用下，適體互補序列會沿著模版生長，形成完全互補雙鏈DNA。(b)將步驟(a)的生成的雙鏈DNA用切割酶切割，得到一條短鏈DNA，同時得到新的生長位點，在聚合酶酶和切割酶的作用下，生長和切割會不斷進行產(chǎn)生大量短鏈DNA。(c)將(b)所得短鏈DNA用化學(xué)發(fā)光探針進行測定，從而實現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：混旭，劉芳，
申請(專利權(quán))人：青島科技大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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