一種MTT法檢測(cè)木霉菌活性的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種MTT法檢測(cè)木霉菌活性的方法，包括以下步驟：（1）制備木霉菌發(fā)酵液，所述木霉菌發(fā)酵液中厚垣孢子濃度為107-108CFU/mL；（2）測(cè)出木霉菌發(fā)酵液在570nm處讀取OD值，此時(shí)，木霉菌的萌發(fā)率為100%；（3）配制不同濃度的木霉菌發(fā)酵液并測(cè)出OD值，根據(jù)測(cè)量值制作木霉菌萌發(fā)率與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；（4）測(cè)出待測(cè)的木霉菌制劑的OD值，將OD值與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，即可得知待測(cè)的木霉菌制劑中木霉菌的萌發(fā)率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明專利技術(shù)克服了傳統(tǒng)的木霉菌厚垣孢子的活性檢測(cè)一般采用傳統(tǒng)的涂平板法，耗時(shí)長(zhǎng)、易受雜菌污染、工作量大等不足，為木霉菌生防制劑的厚垣孢子活性快速檢測(cè)提供了可能，提高了檢測(cè)效率，降低了人們的工作量。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種木霉菌活性的檢測(cè)方法，具體的是通過(guò)MTT比色法，檢測(cè)木霉菌的厚垣孢子存活和生長(zhǎng)的一種方法。
技術(shù)介紹
MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)，甲瓚沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。用有機(jī)溶劑溶解細(xì)胞中的甲瓚，用分光光度計(jì)在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、 細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。而如今大規(guī)模應(yīng)用的MTT法檢測(cè)活細(xì)胞的方法多是動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌等活性檢測(cè)，應(yīng)用于真菌厚垣孢子活性檢測(cè)的很少，而木霉菌屬于真菌。目前，木霉菌厚垣孢子的活性檢測(cè)一般采用傳統(tǒng)的涂平板法，但是檢測(cè)時(shí)間比較長(zhǎng)，并且檢測(cè)過(guò)程要防止雜菌污染，工作量大。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于提供一種MTT法檢測(cè)木霉菌活性的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的木霉菌厚垣孢子的活性檢測(cè)一般采用傳統(tǒng)的涂平板法，檢測(cè)時(shí)間比較長(zhǎng)，并且檢測(cè)過(guò)程要防止雜菌污染，工作量大的技術(shù)性問(wèn)題。本專利技術(shù)目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 一種MTT法檢測(cè)木霉菌活性的方法，包括以下步驟 (1)、制備木霉菌發(fā)酵液，所述木霉菌發(fā)酵液中厚垣孢子濃度為IO7-IO8CFU/mL ； (2)、取上述木霉菌發(fā)酵液200-400uL，再加入MTT水溶液400-600 uL，于40°C水浴3 h，之后加入500 uL lmol/L濃鹽酸終止反應(yīng)；取上清與異丙醇或者異丁醇混合，靜止15min, 12000 r/min離心3 min,取上清用分光光度計(jì)在570 nm處讀取OD值,此時(shí),木霉菌的萌發(fā)率為100% ； (3 )、將步驟(I)的木霉菌發(fā)酵液配制成原濃度的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的溶液；按照步驟(2)的過(guò)程測(cè)量各種濃度的溶液的OD值，根據(jù)步驟(2)與步驟(3)的測(cè)量值制作木霉菌萌發(fā)率與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (4)、將待測(cè)的木霉菌制劑溶解形成溶液，使溶液中木霉菌的厚垣孢子濃度為IO7-IO8CFU/mL，按照步驟(2)的過(guò)程測(cè)量溶液的OD值，將OD值與步驟(3)的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，即可得知待測(cè)的木霉菌制劑中木霉菌的萌發(fā)率。優(yōu)選地，所述步驟(I)中的制備木霉菌發(fā)酵液步驟進(jìn)一步包括將木霉菌菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3-4 d后，用打孔器從菌落邊緣打取菌片3 5個(gè)，接種到H)液體培養(yǎng)基中，于27-29°C、130-150 r / min搖床條件下培養(yǎng)5_6 d，得到木霉菌發(fā)酵液。優(yōu)選地，所述MTT水溶液的濃度為Img /mL。優(yōu)選地，所述步驟(4)中，溶解待測(cè)的木霉菌制劑的溶劑采用純凈水或無(wú)菌種活力的木霉菌發(fā)酵液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn) 1、本專利技術(shù)克服了傳統(tǒng)的木霉菌厚垣孢子的活性檢測(cè)一般采用傳統(tǒng)的涂平板法，耗時(shí)長(zhǎng)、易受雜菌污染、工作量大等不足，為木霉菌生防制劑的厚垣孢子活性快速檢測(cè)提供了可能，提高了檢測(cè)效率，降低了人們的工作量； 2、通過(guò)本專利技術(shù)的檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)木霉菌生防制劑快速檢測(cè)的目的； 3、本專利技術(shù)的檢測(cè)方法還可用于木霉菌生防制劑貨架期長(zhǎng)短的檢測(cè)，為確定貨架期長(zhǎng)短提供了可靠的檢測(cè)方法。附圖說(shuō)明圖I為木霉菌萌發(fā)率與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。具體實(shí)施例方式下面對(duì)本專利技術(shù)的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本專利技術(shù)技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本專利技術(shù)的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例I 制備木霉菌發(fā)酵液將木霉菌菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3-4 d后，用打孔器從菌落邊緣打取菌片3 5個(gè)，接種到H)液體培養(yǎng)基中，于27-29°C、130-150 r / min搖床條件下培養(yǎng)5-6 d，得到木霉菌發(fā)酵液，木霉菌發(fā)酵液中厚垣孢子濃度為IO7-IO8 CFU/mL。取上述木霉菌發(fā)酵液200-400 uL，再加入MTT水溶液400-600 uL，于40°C水浴3 h，之后加入500 uL lmol/L濃鹽酸終止反應(yīng)；取上清與異丙醇或者異丁醇混合，靜止15min, 12000 r/min離心3 min,取上清用分光光度計(jì)在570 nm處讀取OD值,此時(shí),木霉菌的萌發(fā)率為100%。取上述IOOmL發(fā)酵液，于121°C,滅菌15min，得到無(wú)菌種活力的發(fā)酵液，使用該無(wú)菌種活力的發(fā)酵液將上述木霉菌發(fā)酵液配制成原濃度的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的溶液；按照上述過(guò)程測(cè)量各種濃度的溶液的OD值，根據(jù)測(cè)量值制作木霉菌萌發(fā)率與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖I所示。將待測(cè)的木霉囷制劑溶解于無(wú)囷種活力的發(fā)酵液中形成溶液，使溶液中木霉囷的厚垣孢子濃度為IO7-IO8 CFU/mL，測(cè)量溶液的OD值，將OD值與上述的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，即可得知待測(cè)的木霉菌制劑中木霉菌的萌發(fā)率。本專利技術(shù)克服了傳統(tǒng)的CFU檢測(cè)方法(涂平板法)中耗時(shí)長(zhǎng)、易受雜菌污染、工作量大等不足，為木霉菌生防制劑的厚垣孢子活性快速檢測(cè)提供了可能，提高了檢測(cè)效率，降低了人們的工作量。通過(guò)本專利技術(shù)的檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)木霉菌生防制劑快速檢測(cè)的目的。本專利技術(shù)的檢測(cè)方法還可用于木霉菌生防制劑貨架期長(zhǎng)短的檢測(cè)，為確定貨架期長(zhǎng)短提供了可靠的檢測(cè)方法。以上公開(kāi)的僅為本申請(qǐng)的幾個(gè)具體實(shí)施例，但本申請(qǐng)并非局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思之的變化，都應(yīng) 落在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍內(nèi) 。權(quán)利要求1.一種MTT法檢測(cè)木霉菌活性的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)、制備木霉菌發(fā)酵液，所述木霉菌發(fā)酵液中厚垣孢子濃度為IO7-IO8CFU/mL ； (2)、取上述木霉菌發(fā)酵液200-400uL，再加入MTT水溶液400-600 uL，于40°C水浴3 h，之后加入500 uL lmol/L濃鹽酸終止反應(yīng)；取上清與異丙醇或者異丁醇混合，靜止15min, 12000 r/min離心3 min,取上清用分光光度計(jì)在570 nm處讀取OD值,此時(shí),木霉菌的萌發(fā)率為100% ； (3 )、將步驟(I)的木霉菌發(fā)酵液配制成原濃度的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的溶液；按照步驟 (2)的過(guò)程測(cè)量各種濃度的溶液的OD值，根據(jù)步驟(2)與步驟(3)的測(cè)量值制作木霉菌萌發(fā)率與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (4)、將待測(cè)的木霉菌制劑溶解形成溶液，使溶液中木霉菌的厚垣孢子濃度為IO7-IO8CFU/mL，按照步驟(2)的過(guò)程測(cè)量溶液的OD值，將OD值與步驟(3)的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，即可得知待測(cè)的木霉菌制劑中木霉菌的萌發(fā)率。2.如權(quán)利要求I所述的一種MTT法檢測(cè)木霉菌活性的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的制備木霉菌發(fā)酵液步驟進(jìn)一步包括將木霉菌菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3-4 d后，用打孔器從菌落邊緣打取菌片3 5個(gè)，接種到H)液體培養(yǎng)基中，于27-29°C、130-150r / min搖床條件下培養(yǎng)5-6 d,得到木霉菌發(fā)酵液。3.如權(quán)利要求I所述的一種MTT法檢測(cè)木霉菌活性的方法，其特征在于，所述MTT水溶液的濃度為Img /mL。4.本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種MTT法檢測(cè)木霉菌活性的方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）、制備木霉菌發(fā)酵液，所述木霉菌發(fā)酵液中厚垣孢子濃度為107？108？CFU/mL；（2）、取上述木霉菌發(fā)酵液200？400？uL，再加入MTT水溶液400？600？uL，于40℃？水浴3？h，之后加入500？uL？1mol/L？濃鹽酸終止反應(yīng)；取上清與異丙醇或者異丁醇混合，靜止15？min，12000？r/min離心3？min，取上清用分光光度計(jì)在570？nm處讀取OD值，此時(shí)，木霉菌的萌發(fā)率為100%；（3）、將步驟（1）的木霉菌發(fā)酵液配制成原濃度的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的溶液；按照步驟？？（2）的過(guò)程測(cè)量各種濃度的溶液的OD值，根據(jù)步驟（2）與步驟（3）的測(cè)量值制作木霉菌萌發(fā)率與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；（4）、將待測(cè)的木霉菌制劑溶解形成溶液，使溶液中木霉菌的厚垣孢子濃度為107？108？CFU/mL，按照步驟（2）的過(guò)程測(cè)量溶液的OD值，將OD值與步驟（3）的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，即可得知待測(cè)的木霉菌制劑中木霉菌的萌發(fā)率。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳捷，林振亞，余嘉，余傳金，范莉莉，李雅乾，吳瓊，孫瑞艷，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海交通大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：