本發明專利技術公開了一種利用反相高效液相色譜法純化恩夫韋肽的方法，主要解決恩夫韋肽收率極低的技術問題。純化包括如下步驟：1）將恩夫韋肽粗品以稀氨水完全溶解后，以濾膜過濾后待用，以固定相為聚苯乙烯-聚乙烯基苯為基質的聚合物樹脂填料的聚合物色譜柱，流動相中，磷酸鹽緩沖液為A相，色譜乙腈為B相，進行梯度洗脫純化，收集目的峰值含量大于80%的肽溶液；2）以固定相為十八烷基鍵合硅膠的反相硅膠柱進行二次純化同時轉鹽，流動相中，醋酸水溶液為A相，色譜乙腈為B相，收集目的峰值含量大于98%的肽溶液；3）將最終的高純度肽溶液減壓旋蒸濃縮冷凍干燥，得粉末狀成品肽。本發明專利技術提出了一條適合放大生產的高效液相色譜法純化恩夫韋肽的純化工藝。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于反相HPLC
，尤其是涉及ー種規模化純化恩夫韋肽的方法。
技術介紹
恩夫韋肽是ー種人工合成的由36個氨基酸組成的鏈狀多肽。是白色或灰白色非晶型固體，在純水中幾乎不溶，但在PH7. 5的緩沖液中溶解度達到82 142g/ml。分子式為C 204 H 301N5i O64。分子量為 4492。其結構式為=CH3CO-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2o恩夫韋肽為合成肽類HIV融合抑制藥，可與病毒包膜糖蛋白結合，阻止病毒與細胞膜融合所必需的構象變化，從而抑制HIV-I的復制。它是近7年來抗艾滋病治療藥的先鋒，是第一個融合抑制劑。其它抗艾滋病藥物是作用于細胞內部，阻止病毒在細胞內部復 制；而這ー藥物卻是通過阻止病毒與T細胞等免疫細胞的接觸融合，干擾HIV-I進入T細胞，防止艾滋病患者的免疫系統遭受病毒破壞來發生作用，因此又稱為融合抑制劑。目前涉及關于恩夫韋肽的報道基本都是合成エ藝方面，而在純化工藝上基本沒有，因恩夫韋肽的理化性質，在酸性及中性環境中溶解度極低，因此造成其在HPLC上純化的困難，使其收率極低，本專利技術通過在堿性環境中使用的色譜條件有效解決了這個問題，從而達到提聞收率的目的。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一條適于規模化生產恩夫韋肽的純化方法，主要解決恩夫韋肽在酸性及中性環境中溶解度極低，因此造成其在HPLC上純化的困難，使其收率極低的技術問題。本專利技術使用反相高效液相色譜法純化恩夫韋肽，并用HPLC轉鹽法交換轉鹽，效率高，成本低且收率好，達到產業化的要求，解決現有技術分離得到恩夫韋肽的空白。為實現上述目的，本專利技術的技術方案如下，包括如下步驟 I)將恩夫,妝粗品以稀氣水完全溶解后，以濾I吳過濾后待用，以固定相為聚合物色譜柱，流動相為兩相，磷酸鹽緩沖液為A相，色譜こ腈為B相，進行梯度洗脫一次純化，收集目的峰值含量大于80%的肽溶液； 2)以固定相為反相硅膠色譜柱進行二次純化同時轉鹽，流動相為兩相，醋酸水溶液為A相，色譜こ腈為B相，收集目的峰值含量大于98%的肽溶液； 3)將最終的高純度肽溶液減壓旋蒸濃縮冷凍干燥，得粉末狀成品肽。更為優選的方案是所述聚合物色譜柱是以聚苯こ烯-聚こ烯苯為基質的聚合物樹脂填料為固定相的聚合物色譜柱。更為優選的方案是所述磷酸鹽緩沖液pH為7. 5-8. O。更為優選的方案是所述步驟I)中梯度洗脫的B相體積百分濃度為30% 50%，檢測波長為230nm。更為優選的方案是所述二次純化及轉鹽所用制備柱為以十八烷基鍵合硅膠填料為固定相的反相硅膠色譜柱。更為優選的方案是所述二次純化及轉鹽中醋酸水溶液體積百分濃度為2. 0%，梯度洗脫的B相體積百分濃度為5% 20% 25%，檢測波長為230nm。本專利技術的有益效果是本專利技術提出的一條適于規模化生產恩夫韋肽的純化工藝方法，先以聚合物制備柱在堿性條件下進行一次純化得到純度80%以上的產品，再以C18填料的制備柱進行二次純化同時轉鹽，不僅能得到HPLC純度大于98. 0%的精肽，還有效地提高了產品的收率，降低了成本，同時生產方法簡單，易于操作，從而達到大規模エ業化生產的目的。具體實施方式 實施例I I.樣品處理稱取2g恩夫韋肽粗品于燒杯中，邊加入體積百分濃度為5%稀氨水邊超聲至液體澄清，用孔徑為O. 45um濾膜過濾后收集濾液備用。2. 一次純化 純化條件色譜柱以固定相為聚苯こ烯-聚こ烯基苯為基質的聚合物樹脂填料的聚合物色譜柱，柱子直徑和長度為3CmX25Cm.流動相A相20mmol/l磷酸氫ニ鈉水溶液，以氨水調PH為7. 5-8. O ；B相:色譜こ腈。流速:15-20ml/min。檢測波長:230nm。梯度B相體積百分濃度為30-50%，30-50min。進樣量為2. 0-2. 5g。純化過程將色譜柱用體積百分濃度為30%的B相平衡好后上樣，進行線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用。3. 二次純化及轉鹽 純化條件色譜柱以固定相為十八烷基鍵合硅膠的反相硅膠柱色譜柱，柱子直徑和長度為3CmX25Cm.流動相A相體積百分濃度為2. 0%醋酸水溶液；B相色譜こ腈。流速30-35ml/min。檢測波長230nm。梯度B相體積百分濃度為5_20%，0_60min ；20-25%,60-90min。進樣量為一次純化兩針粗品收集的肽溶液。純化過程將色譜柱用體積百分濃度為5%的B相平衡好后上樣，進行線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用。4.將轉鹽后所得的所有肽溶液，進行減壓濃縮至lg/100ml，濃縮溫度不超過400C，然后冷凍干燥得純度大于98. 0%的恩夫韋肽，純化收率52. 3%。實施例2 I.樣品處理稱取5g恩夫韋肽粗品于燒杯中，邊加入體積百分濃度為5%稀氨水邊超聲至液體澄清，用孔徑為O. 45um濾膜過濾后收集濾液備用。2. 一次純化 純化條件色譜柱以固定相為聚苯こ烯-聚こ烯基苯為基質的聚合物樹脂填料的聚合物色譜柱，柱子直徑和長度為5CmX25Cm.流動相A相20mmol/l磷酸氫ニ鈉水溶液，以氨水調PH為7. 5-8. O ;B相色譜こ腈。流速35-40ml/min。檢測波長230nm。梯度B相質量百分濃度為30-50%，30-50min，上樣量為5. 0-5. 5g。 純化過程將色譜柱用體積百分濃度為30%的B相平衡好后上樣，進行線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用。3. 二次純化及轉鹽 純化條件色譜柱以固定相為十八烷基鍵合硅膠的反相硅膠柱色譜柱，柱子直徑和長度為5CmX25Cm.流動相A相體積百分濃度為2. 0%醋酸水溶液；B相色譜こ腈。流速50-55ml/min。檢測波長230nm。梯度B相體積百分濃度為5_20%，0_60min ；20-25%,60-90min。進樣量為一次純化兩針粗品收集的肽溶液。純化過程將色譜柱用體積百分濃度為5%的B相平衡好后上樣，進行線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用。4.將轉鹽后所得的所有肽溶液，進行減壓濃縮至lg/100ml，濃縮溫度不超過 400C，然后冷凍干燥得純度大于98. 0%的恩夫韋肽，純化收率46. 6%。實施例3 I.樣品處理稱取15g恩夫韋肽粗品于燒杯中，邊加入體積百分濃度為5%稀氨水邊超聲至液體澄清，用孔徑為O. 45um濾膜過濾后收集濾液備用。2. 一次純化 純化條件色譜柱以固定相為聚苯こ烯-聚こ烯基苯為基質的聚合物樹脂填料的聚合物色譜柱，柱子直徑和長度為10CmX25Cm.流動相A相20mmol/l磷酸氫ニ鈉水溶液，以氨水調pH為7. 5-8. O ;B相色譜こ腈。流速55_60ml/min。檢測波長230nm。梯度B相體積百分濃度為30-50%，30-50min。進樣量為15_18g。純化過程將色譜柱用體積百分濃度為30%的B相平衡好后上樣，進行線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集好的肽溶液放置收本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種純化恩夫韋肽的方法，其特征是包括如下步驟：1）將恩夫韋肽粗品以稀氨水完全溶解后，以濾膜過濾后待用，以固定相為聚合物色譜柱，流動相為兩相，磷酸鹽緩沖液為A相，色譜乙腈為B相，進行梯度洗脫純化，收集目的峰值含量大于80%的肽溶液；2)？以固定相為反相硅膠色譜柱進行二次純化同時轉鹽，流動相為兩相，醋酸水溶液為A相，色譜乙腈為B相，收集目的峰值含量大于98%的肽溶液；3）將最終的高純度肽溶液減壓旋蒸濃縮冷凍干燥，得粉末狀成品肽。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：徐紅巖，任麗萍，
申請(專利權)人：吉爾生化上海有限公司，上海吉爾多肽有限公司，濱海吉爾多肽有限公司，
類型：發明
國別省市：
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