HLA-G亞型作為成骨標記物的用途制造技術

本發明專利技術涉及至少一種HLA-G亞型作為評估哺乳動物成骨標記物的用途。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一個新的成骨標記物，以及其在評價哺乳動物成骨的方法中的用途。
技術介紹
成骨是一個骨組織形成和發展的過程。骨由以下形成-骨細胞外基質(大約22%至25%)，其為基本上由I型膠原蛋白組成的有機基質，但也含有其它的蛋白質，如骨結合素和骨鈣素，-非常富含鈣的礦物基質(大約70%)，-兩種類型的骨細胞成骨細胞(來源于間質干細胞的成骨細胞、骨細胞和襯細胞)和破骨細胞(來源于造血干細胞的細胞)，和 -水(5%至 8%)。成骨細胞是立方體形或圓柱形單核上皮樣細胞，其存在于生長中的骨組織。其特征性地表達I型膠原蛋白、堿性磷酸酶(ALP (法文為PA)或ALPL)、甲狀旁腺激素受體I (PTHR1)、骨結合素(SPARC)、骨鈣素、Osterix轉錄因子(OSX)和α-肌動蛋白(ASMA)(Cohen,2006)。骨細胞是分化的成骨細胞，其高度地分枝且能夠分裂。其維持骨細胞外基質。襯細胞是靜止細胞，其具有扁平的長的形狀，并位于骨表面的無活性區，即，既不處于骨的形成中，也不處于骨的吸收中的區域。如果它們被刺激，則可分化成成骨細胞。破骨細胞是直徑為20至100 μ m的多核細胞。它們負責骨的吸收。具有成骨標記物對于評估骨骼退化(例如骨質疏松)個體中的骨折風險、對于監控骨折后骨骼再建以及對于監控骨腫瘤的發展都是重要的。如果處于早期，這種風險評估和監控對于建立有效的治療是重要的。舉一個例子，患有脛骨骨折的10至30%的成年人出現假關節，即，發生骨折后兩個骨折片缺乏固結作用。在法國，這代表了每年大約3000個病例。假關節的治療非常困難(自體移植、骨髓注射、生長因子注射等)，而且昂貴，且不能保證病人快速恢復獨立性。在法國，脛骨缺乏固結作用的年花費估計在3百至3千萬歐元。因而，假關節的早期檢測使更有效地治療患此病的病人成為可能。目前在市場上沒有幾個骨形成(成骨)的標記物。這些標記物基本上是骨堿性磷酸酶、骨鈣素和前膠原蛋白延伸前肽(Srivastava, 2005和Vesper，2005)-堿性磷酸酶(ALP(法文為PA)或ALPL)是普遍存在的酶。在人類中可分為6種同工酶肝臟、腸、骨、腎、胎盤和腫瘤同工酶。在肝功能正常的成人中，ALP血清活性的大約60-70%來自肝臟，30-40%來自骨，少于5%來自腸。骨ALP的循環水平取決于成骨細胞的活性，但也取決于它的肝臟清除；結果，在肝病的情況下，有可能出現循環中的骨ALP水平的改變；-骨鈣素(OC)是成骨細胞分泌的5.7kDa的蛋白質。在血流中，骨鈣素快速降解和清除(循環中的骨鈣素的1/3為全長蛋白，2/3為各種大小的片段)，因而，限制了其作為骨形成標記物的臨床應用；-I型膠原蛋白以前膠原蛋白的形式由成骨細胞合成。這種前體包括在N-末端和C-末端的兩個前肽，分別為PINP (N-末端延伸前肽)和PICP (C-末端延伸前肽)，在前膠原蛋白裝配成三螺旋時，其被蛋白酶切斷，并釋放入循環中。因而，分析血清中的這些前肽可以評估I型膠原蛋白的形成。但是，這種分析反映的不僅僅是骨中的I型膠原蛋白的形成，也包括其它組織中的。因而，目前使用的成骨標記物是不十分滿意的。因此，需要鑒別新的成骨標記物。主要組織相容性復合物(MHC)(法文為CMH)抗原被分為幾類I類抗原(HLA-A、HLA-B和HLA-C)，其具有3個球形結構域(α I、α 2和α 3)，且其α 3結構域與β 2微球蛋白相關，II類抗原(HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR)和III類抗原(補體)。I類抗原除了上面提到的抗原以外，還包括其它的命名為非傳統I類抗原的(Ib類)抗原，以及特別地，HLA-E、HLA-F 和 HLA-G 抗原。 HLA-G基因(HLA-6. O基因)的核苷酸序列已被Geraghty等人(1987)描述了 其包括4396個堿基對，具有與HLA-A、-B和-C基因的內含子/外顯子結構同源的內含子/外顯子結構。這個基因包括8個外顯子、7個內含子和一個非翻譯3’端。HLA-G基因不同于其它I類MHC基因，因為框內翻譯終止密碼子位于外顯子6的第二個密碼子；因而，此HLA-6. O基因編碼的蛋白的胞質區域比HLA-A、-B和-C蛋白的胞質區域短。Ishitani和Geraghty (1992)已經表明HLA-G基因的初級轉錄物可以以幾種方式被剪接，并生成至少3種不同的成熟mRNA :初級HLA-G轉錄物提供了 1200bp的全長拷貝(Gl),900bp的片段(G2)和600bp的片段(G3)。Gl轉錄物不包括外顯子7，且對應于Ellis等人(1990)描述的序列，即，其編碼含有信號序列、三個胞外球形結構域(α I、α 2和α 3)、跨膜結構域和胞質內結構域的蛋白。G2mRNA不包含外顯子3(編碼α 2結構域)，并編碼α I和α 3結構域直接連接的亞型。G3mRNA既不含有外顯子3又不含外顯子4 (編碼α 3結構域)；因而，該轉錄物編碼α I結構域和跨膜結構域直接連接的亞型。為了得到HLA-G2抗原，流行的剪接導致了腺嘌呤(A)(源于α I編碼結構域)與腺嘌呤-胞嘧啶(AC)序列(源于α 3編碼結構域)的結合，其導致取代存在于編碼HLA-Gl中的α 3結構域的序列5’位置中GAC (天冬氨酸)密碼子的AAC (天冬酰胺)密碼子的產生。為了獲得HLA-G3產生的剪接并沒有引起在剪接區域中新密碼子的形成。一些專利技術人已經表明HLA-G mRNA的其它剪接形式的存在不包含外顯子4的HLA-G4轉錄物；HLA-G5轉錄物，其在外顯子4和5之間包括內含子4，從而在此轉錄物的翻譯期間引起讀碼框的改變，特別是在內含子4的氨基酸21后出現一個終止密碼子；HLA-G6轉錄物，其具有內含子4，但沒有外顯子3 ;和HLA-G7轉錄物，其包含內含子2，從而在此轉錄物的翻譯期間引起讀碼框的改變，且在內含子2的氨基酸2后出現一個終止密碼子(Kirszenbaum 等人，1994 和 1995 ；Moreau 等人，1995 ;歐洲申請 EP O 677 582)。因而，至少有7種不同的HLA-G mRNA,其編碼7種HLA-G的亞型，其中的4個是細胞膜亞型(HLA-G1、-G2、-G3和-G4)，3個是可溶的亞型(HLA-G5、-G6和-G7，其不包含跨膜結構域)(綜述參見Carosella等人,2008a)。HLA-G基因(HLA-6. O基因)的核苷酸序列及其外顯子/內含子組織，以及HLA-G各種亞型的氨基酸序列是本領域技術人員公知的。其特別地被描述于上面提及的Geraghty等人(1987)和 Carosella 等人(2008a)中。HLA-G蛋白表達正常地被限于滋養層(在母胎層面)、胸腺、角質層、內皮的和成紅細胞前體和間質干細胞(Carosella等人，2008a)。但是，事實上在身體的所有細胞中都檢測到處于基礎水平的HLA-G mRNA，其可被擴增，并在DNA-脫甲基化制劑、細胞因子如干擾素(IFN)、應激因子或缺氧的作用下誘導可被翻譯成蛋白(Carosella等人，2008b)。因而，在特定的條件下，例如組織移植、某些腫瘤或炎癥反應的發生時，HLA-G蛋白可以在正常條件下不表達其的組織中表達。在血液中，發現了可溶性本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：F·德沙索，L·桑塞貝，N·魯阿弗雷斯，A·納吉，E·D·卡羅塞拉，
申請(專利權)人：原子能和能源替代品委員會，法國血液機構，
類型：
國別省市：