本發(fā)明專利技術涉及一種粘紅酵母油脂基因工程菌及其構建方法和應用，其基因工程菌的構建方法主要利用粘紅酵母rDNA為同源整合的靶序列，將釀酒酵母的強啟動子基因PGK1和卷毛枝霉的蘋果酸酶基因ME構建成表達載體引入粘紅酵母，使ME基因在粘紅酵母體內(nèi)獲得高效表達，轉化株脂質含量較野生菌株提高2.5倍。本發(fā)明專利技術在了解微生物油脂合成代謝的基礎上，通過導入脂質合成代謝的關鍵酶基因和強啟動子，將為調(diào)控脂質代謝，提高油脂產(chǎn)量。該基因工程菌株可應用于微生物油脂的生產(chǎn)和功能性油脂相關產(chǎn)品的開發(fā)，如藥品，保健品等。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程領域，具體涉及一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌的構建方法。
技術介紹
粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis (Fres. ) Harrison)是一種重要的產(chǎn)油微生物，可以產(chǎn)生微生物油脂和其他活性物質，類胡蘿卜素，L-苯丙氨酸，SOD等，并在一定條件下，產(chǎn)生a-丙氨酸和谷氨酸。由于其營養(yǎng)要求簡單、粗放，可用蔗渣、廢糖蜜等作為培養(yǎng)基質，成本較低。尤其是其脂質含量明顯高于其他產(chǎn)油微生物，近年來人們越來越專注于其產(chǎn)油功能的開發(fā)研究，并對其發(fā)酵工藝進行了研究，使粘紅酵母產(chǎn)油量獲得了一定的提高。但是 靠外在的生長環(huán)境的改變使其產(chǎn)油量獲得更高的提升顯然不現(xiàn)實。目前對于產(chǎn)油粘紅酵母基因工程改造方面的研究較為匱乏，還未見有文獻報道將產(chǎn)油相關基因導入粘紅酵母內(nèi)表達，對于粘紅酵母基因工程改造的資料也幾乎處于空白。產(chǎn)油微生物油脂合成代謝調(diào)控過程有兩個關鍵酶，檸檬酸裂解酶(ACL)和蘋果酸酶(ME) (Adams IP,et al. The distinctiveness of ATP:citratelyase fromAspergillus nidulans. Biochem Biophys Acta, 2002),大量研究表明，產(chǎn)油微生物油月旨積累的多少與ME的代謝調(diào)控有關，如果ME受到抑制，則油脂積累下降。這是因為雖然微生物代謝途徑中有許多生成NADPH的過程，但FAS幾乎只能利用由ME產(chǎn)生的NADPH(Wynn JP,etal. The role ofmalic enzymein the regulation of lipid accumulationin filamentous fungi. Microbiology, 1999)。研究表明，以卷枝毛霉為模式有機體，在蘋果酸酶活性的特異性抑制劑芝麻酚的作用下，其脂肪積累量從25%下降到2%，而其菌體生長沒有任何負面的影響(Song Y，et al. A pregenetic study of the isoformsof malic enzyme associated with lipid accumulation in Mucor circinelloides.Microbiology, 2001.)。進一步證實了 ME的活性與脂肪積累量之間存在直接的相關性。因此，如果能鑒定和分離產(chǎn)油微生物的ME基因，就可以利用基因工程手段甚至化學生物學手段選擇性調(diào)控蘋果酸酶的活性，提高微生物產(chǎn)油能力。rDNA在酵母基因組中有100-200個重復單兀(Scopione RC, et al. A new promoter probe vector for Saccharomteescerevisiae using fungal glucoamylase cDNA as the reporter gene. Yeast, 1993.),以rDNA為同源整合的靶順序構建的載體，既克服了通常整合載體只有單拷貝或幾個拷貝的局限，同時又保留整合載體穩(wěn)定性好的特點，所以是一類用于表達外源基因理想的載體系統(tǒng)。目前這種策略已成功在多種微生物中構建并實現(xiàn)表達應用，如Bacillus subtilis、Saccharomy cerevisiae、Pichia pastoris、Candida albicans、Kluyveromyces lactis、Phaffa rhodozyma、Hansenula Polymorpha、Arxula adeninivorans 等(Jens K, CornelisPH, etal. Integration of heterologous genes in several yeast species usingvectors containing a Hansenula polymorpha-derived rDNA-targeting element.FEMS Yeast Research, 2003 ；Mahadtanapuk S,etal. Cloning of antifungal gene fromBacillus licheniformis by application of low energy ion beam bombardment.Surface&Coatings Technology,2009.)。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的在于提供一種粘紅酵母野生菌株(Rhodotorulaglutinis)。本專利技術的目的還在于提供一種粘紅酵母野生菌株的構建方法，以提高粘紅酵母的產(chǎn)油量。本專利技術的目的還在于提供了一種粘紅酵母野生菌株的應用。為了實現(xiàn)上述目的，本專利技術的技術方案采用了粘紅酵母GM4 (Rhodotorulaglutinis GM4)，于2012年6月5日保藏在位于中國湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2012203。 本專利技術的技術方案還在于采用了一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌的構建方法，利用粘紅酵母rDNA為同源整合的靶序列，將釀酒酵母的強啟動子基因PGKl和卷枝毛霉的蘋果酸酶基因ME構建成表達載體引入粘紅酵母，使ME基因在粘紅酵母體內(nèi)獲得高效表達，其基因工程菌的構建的具體步驟如下A、目的基因的獲取(I)采用珠磨與酚氯仿結合法提取粘紅酵母的總基因組DNA ;將提取的總DNA純化后點樣于1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，此基因組模板分裝后于_20°C保存，并用于后序的PCR反應；根據(jù)粘紅酵母基因組中rDNA的保守序列設計了兩對引物擴增26SrDNA D1/D2片段和5. 8SrDNA-ITS 片段；(2)以卷枝毛霉基因組為模板，根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中蘋果酸酶同源保守的氨基酸序列設計簡并引物，引物設計如下Fr5’ -AATCATTCCTCTCTCGAGCTCTCAACAGAAATGTCG-3’ 如 SEQ IDN0. 2 所示Rr5’ -CTATATTGCGGCCGCTACTACAACTACAATTTACCAGC-3’ 如 SEQ IDN0. 3 所示PCR擴增得到大小為2. Ikb的ME基因片段，通過A-T克隆插入pMD_T質粒載體，獲得pMD-ME，轉入E. coli DH5 a，篩選陽性轉化子，經(jīng)XhoI和NotI消化轉入pPICZ-E，構建pPICZ-ME載體；(3)強啟動子PGKl的獲取及載體的構建提取釀酒酵母YS58基因組DNA，根據(jù)PGKl基因保守序列設計引物擴增啟動子PGKl基因，引物設計如下Fr :5’ -ACTGAATTCTATTTAGATTCCTGACTTCAACTC-3’ 如 SEQ IDN0. 4 所示EcoRIRr :5’ -TATGGATCCTGTTTTTATATTTGTTGAAAAAGTAG-3’ 如 SEQ IDN0. 5 所示BamHI將PCR擴增的PGKI基因純化后直接與PMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀純化后電轉化感受態(tài)細胞DH5a，經(jīng)驗證結果為陽性的克隆再抽提質粒進行酶切驗證；B、同源重組表達載體pPICZ-rD-ME的構建將ME基因酶切連接到質粒pPICZ-rD上，構建多順反子并與抗性基因Zeocin共用一個PGK本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌GM4（Rhodotorula？glutinis），其特征在于：保藏編號為:CCTCC？NO:M2012203。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：孫晗笑，王一楊，李智，孫晗蓄，馮麗霞，孫長偉，匡超，周瑞秒，
申請(專利權)人：南陽奇?zhèn)ノ⑸鷳B(tài)基因科技開發(fā)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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