一種雜合肽囊素佐劑及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于分子免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雜合肽囊素佐劑及其制備方法和應(yīng)用。主要技術(shù)方法如下：先設(shè)計(jì)出14個(gè)囊素三肽的氨基酸序列（Lys-His-Gly-NH2）和2個(gè)活性四肽的氨基酸序列（Lys-Asn-Pro-Tyr）密碼子為主體的雜合肽囊素N197的核酸序列。接著構(gòu)建了重組表達(dá)載體PET32a-N197，將其轉(zhuǎn)入BL-21（DE3）大腸桿菌后，雜合肽囊素N197獲得了高效表達(dá)。純化后的雜合肽囊素N197具有顯著的免疫佐劑的特性。本發(fā)明專利技術(shù)中的雜合肽囊素N197具有高效的佐劑特性，且利用大腸桿菌系統(tǒng)可以在體外對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，其生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)效率高，生物活性好，非常適合企業(yè)化生產(chǎn)，具有很好的作為畜禽免疫佐劑的應(yīng)用前景。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于分子免疫學(xué)
，具體涉及一種雜合肽囊素佐劑及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
Lys-His-Gly-NH2三肽是一種可以誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化的激素樣物質(zhì)，它不僅可以通過(guò)誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化和作用于B淋巴細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫球蛋白的多樣化性產(chǎn)生影響，而且還可以促進(jìn)機(jī)體的IgM向IgG的方向發(fā)生變轉(zhuǎn)，因其最早是從雞法氏囊中提取的，所以稱之為囊素三肽。1991年，Aydhya等發(fā)現(xiàn)囊素不僅僅存在于禽類法氏囊中，還存在于哺乳動(dòng) 物的骨髓和膽管上皮細(xì)胞中。在哺乳動(dòng)物中分離的囊素是以前囊素狀態(tài)出現(xiàn)的，它是一種序列為 Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg 的 14 妝結(jié)構(gòu)。從序列上我們可以看出其第9位、第10位和第11位這三個(gè)連續(xù)的氨基酸正好是囊素三肽的序列。Aydhya的研究還證實(shí)了此14肽的前囊素與囊素三肽有著相似的生物學(xué)活性。因此，我們可以推斷融合狀態(tài)的前囊素并不影響三肽生物活性的發(fā)揮。近年來(lái)國(guó)外對(duì)有免疫活性的多肽的序列和結(jié)構(gòu)有詳細(xì)的研究，其中有一種叫做加加尼翁(Gagnon’s peptide)的四肽,其氨基酸序列為L(zhǎng)ys-Asn-Pro_Tyr。這個(gè)四肽序列被證實(shí)也是B細(xì)胞刺激物，可以增加雞新城疫疫苗等抗體效價(jià)。為了研究重組疫苗免疫佐劑，本研究利用分子生物學(xué)的方法設(shè)計(jì)了 14個(gè)囊素三肽和2個(gè)加加尼翁四肽的雜合序列，并在序列的末端增加了 6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽序列，最終序列長(zhǎng)度為197bp，我們命名其為雜合肽囊素N197。通過(guò)合成N197的雜合多肽序列以及體外和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證基因工程免疫增強(qiáng)劑雜合多肽的免疫活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
(一)本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可廣泛用于疫苗制備，生產(chǎn)成本低，免疫佐劑效果好的新型雜合肽囊素免疫佐劑及其制備方法和應(yīng)用。(二)本專利技術(shù)的技術(shù)方案是I雜合肽囊素N197的設(shè)計(jì)合成14個(gè)囊素三肽的氨基酸序列(Lys-HiS-Gly-NH2)和2個(gè)加加尼翁活性四肽的氨基酸序列(Lys-Asn-Pro-Tyr)所對(duì)應(yīng)的密碼子共有150bp的核苷酸。另外，在核酸序列的前面添加一個(gè)起始密碼子的序列(3bp)和一個(gè)限制性內(nèi)切酶EcoRI的酶切位點(diǎn)(6bp)。在序列的末端加上6個(gè)組氨酸的序列(18bp)，一個(gè)終止密碼子(3bp)，另外加上三個(gè)限制性內(nèi)切酶(Xho I1Sal I1Pst I)的核酸序列(17bp)。這樣設(shè)計(jì)好的雜合肽囊素核酸序列共包括197個(gè)核苷酸(N197序列)。2含有雜合肽囊素N197序列原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定把合成好的雜合肽囊素N197序列與線性化后的PET32a(Novagen公司商品化產(chǎn)品)原核表達(dá)載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主后，用酶切鑒定的方法篩選含N197的PET32a載體的宿主菌。3雜合肽囊素在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)以終濃度為ImM的IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)對(duì)含雜合肽囊素序列的宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)以含PET32a空載體質(zhì)粒的BL-21菌同樣誘導(dǎo)處理后樣品為陰性對(duì)照。以SDS-PAGE電泳結(jié)果來(lái)分析雜合肽囊素在大腸桿菌中的表達(dá)水平。4重組大腸桿菌雜合肽囊素N197的純化利用SDS-PAGE電泳來(lái)對(duì)雜合肽囊素N197的表達(dá)條帶進(jìn)行分離，并通過(guò)切膠回收的方法對(duì)重組雜合肽囊素N197進(jìn)行分離、純化，并可以進(jìn)一步利用SDS-PAGE電泳對(duì)切膠回收的雜合肽囊素N197的純度進(jìn)行分析。 5純化后的重組雜合肽囊素N197的體外免疫活性測(cè)定(碧云天生物公司的CCK8試劑盒)取雞外周血，并分離出淋巴細(xì)胞，在LPS的作用下，測(cè)定純化后的重組雜合肽囊素N197在體外促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖的免疫活性，并設(shè)立相應(yīng)的陰性對(duì)照和空白對(duì)照。6重組雜合肽囊素N197體外免疫佐劑活性的測(cè)定把I日齡的SPF級(jí)白色來(lái)航雞在SPF飼養(yǎng)至10日齡后分為A，B，C和D等4組，每組3只雞。其中A組為商品化的雞傳染性法氏囊病滅活疫苗免疫組(采用市售商品化雞傳染性法氏囊病的滅活苗在雞頸部皮下注射200 μ I) ；Β組為聯(lián)合免疫組(用商品化的雞傳染性法氏囊病滅活疫苗頸部皮下注射加200 μ I切膠回收的O. 14mg/ml的N197) ；C組為陽(yáng)性攻毒組(不免疫，進(jìn)行攻毒);D組為空白對(duì)照組(不免疫，不攻毒)。對(duì)各組中需要免疫的雞只按上述方案進(jìn)行免疫，在24日齡時(shí)加強(qiáng)免疫一次，疫苗接種劑量及各組免疫增強(qiáng)劑的添加情況同第一次免疫。7雜合肽囊素N197對(duì)商品化雞IBD疫苗免疫抗體水平的影響在第二次免疫13日后，即雞群37日齡時(shí)對(duì)雞群進(jìn)行翅靜脈采血。具體方法如下 (I)固定雞只，使雞的翅膀上翻(注意勿使雞翅膀折傷或脫臼)；(2)在雞翅中部選取翅靜脈比較清楚的位置用70%酒精棉球消毒并使血管得以擴(kuò)張;(3)用Iml的一次性無(wú)菌注射器在消毒部位采血約Iml/只；(4)將采集的雞血在室溫放置Ih后于4°C冰箱過(guò)夜。次日，以2000rpm，4°C離心IOmin并小心吸取上清；(5)采用瓊擴(kuò)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定血清中雞IBD抗體的水平和效價(jià)。中間孔加入標(biāo)準(zhǔn)雞傳染性法氏囊病瓊擴(kuò)抗原，周圍的孔中分別加入采集的免疫雞群及對(duì)照組實(shí)驗(yàn)雞只的抗血清。8雜合肽囊素N197對(duì)攻毒后雞法氏囊的保護(hù)作用分析雞群采血后立即對(duì)其進(jìn)行攻毒，每只雞采用滴眼的方式滴加90 μ I雞IBDV的強(qiáng)毒株BC6/85的病毒液(約1000 EID5tlX攻毒6天后，處死所有雞群并對(duì)其進(jìn)行剖檢。主要取雞的脾臟和法氏囊組織稱重后立即放入10%的福爾馬林溶液進(jìn)行固定后進(jìn)行病理切片分析。(三)本專利技術(shù)其有益效果是目前，畜禽疫苗所使用的佐劑主要還是礦物油類佐劑為主，雖然油佐劑的免疫效果得到了認(rèn)可，但是其的主要缺陷在于其具有一定的毒副作用(引起局部炎癥等等)。本研究制備的雜合肽囊素N197作為疫苗佐劑主要有如下幾方面的有益效果I雜合肽囊素N197是一種高效、低廉，安全的畜禽疫苗佐劑囊素三肽作為疫苗佐劑的免疫促進(jìn)作用已被廣泛證實(shí)，但是由于天然提取的囊素三肽工藝復(fù)雜，得率較低，成本昂貴，所以用天然提取的囊素工作畜禽用佐劑幾乎沒(méi)有可能性。而本研究采用大腸桿菌系統(tǒng)在體外表達(dá)雜合肽囊素N197，此方法獲得的重組蛋白的效率很高，且大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白的成本比較低，因此，雜合肽囊素N197是一種高效，低廉的免疫佐劑。另外，由于囊素三肽和加加尼翁活性四肽是家禽等生物體內(nèi)本身存在的一種小肽，且多肽在自然環(huán)境中易降解，因此，把多個(gè)囊素三肽和加加尼翁活性四肽的密碼子串聯(lián)后，在體外表達(dá)的重組雜合肽囊素N197對(duì)畜禽來(lái)說(shuō)應(yīng)該是一種比較安全的免疫佐劑。2重組雜合肽囊素N197是一種具有廣譜促免疫作用的免疫佐劑 該佐劑能提高多種畜禽疫苗的免疫效果，這直接減少了畜禽患病的機(jī)會(huì)，間接增加了養(yǎng)殖戶的收入和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。同時(shí)，該新型佐劑的應(yīng)用可望提高傳統(tǒng)疫苗的免疫效果，降低畜禽重大傳染病的防治成本。3重組雜合肽囊素N197是一種綠色、環(huán)保的免疫佐劑該免疫佐劑可降低畜禽疫苗抗原的使用量，從而減少了因大量繁殖病毒對(duì)疫苗生產(chǎn)區(qū)域的環(huán)境和疫苗使用場(chǎng)所周圍環(huán)境的污染程度，降低企業(yè)的生產(chǎn)成本，是一種綠色、環(huán)保免疫佐劑。此外，重組雜合肽囊素N197屬于重組多肽佐劑，其在自然界中可以被降解，不會(huì)對(duì)環(huán)境和其他生物造成生物危害。四附本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種雜合肽囊素N197佐劑，其特征是由14個(gè)囊素三肽的氨基酸序列Lys？His？Gly？NH2和2個(gè)活性四肽的氨基酸序列Lys？Asn？Pro？Tyr及6個(gè)組氨酸組成的雜合多肽序列。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：沈萍萍，蔡梅紅，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南京大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：