促視網膜色素上皮細胞擴增的水凝膠細胞支架的制備方法技術

一種促視網膜色素上皮細胞擴增的水凝膠細胞支架的制備方法，將電解質高分子單體溶液與中性高分子單體溶液混合均勻后，加入引發劑，再次混合均勻后在避光條件下利用氮氣脫氧后加入板狀合成模具中，制備出來的水凝膠細胞支架克服了易于老化，且無法有效地附著在視網膜上以及移植的視網膜色素上皮細胞無法附著在視網膜中央窩上形成細胞層的缺點，實現并促進人體視網膜色素上皮細胞能夠粘附、鋪展和增殖，可以起到防止其老化功能的高分子水凝膠細胞支架。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物材料
，具體涉及一種。
技術介紹
年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)已經成為危害全世界人類眼部健康的一種不容忽視的疾病。世界衛生組織的研究報告表明，AMD致盲者約占全球盲人的8. 7%，全球約有3000萬AMD患者，每年約有50萬人因為AMD而致盲。美國2004年報告約有175萬AMD患者，AMD的患病率為1. 47%，而到2020年，推測將有高達 300萬的AMD患者。我國鄒海東等人的一項調查結果顯示，50歲以上人群的AMD患病率為 15.5%。按照聯合國的人口數據資料，我國在2005年50歲以上的人口數接近3億，按照這個比例，我國50歲以上AMD患者總數應該接近400萬，在新加坡這個以華人為主的國家， AMD也逐漸成為主要的致盲原因，60歲以上人群患病率為27%，由此可見，隨著人口的老齡化，AMD的患病率將逐年增高，隨之而帶來的公共衛生問題亦不能忽視。研究結果表明AMD的發病與視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE) 細胞的萎縮和變性有著很大的關系。視網膜色素上皮細胞位于神經視網膜和脈絡膜之間， 在正常的情況下，視網膜色素上皮細胞在很多重要的眼部功能中都起著關鍵性的作用，如吞噬感光細胞外節段，神經視網膜的生理吸附，血視網膜的維護以及眾多離子、生長因子和細胞因子的運輸和分泌。它的退化可以誘發出很多視網膜疾病，包括AMD。當RPE細胞受到損傷時，成熟的視網膜色素上皮細胞會停止增生，而產生形態的增大。在這種病理情況下， 功能缺失或者惡化了的視網膜色素上皮細胞最終會導致與之相關的光感受器的損傷而產生視力的退化。在AMD這種病變中，視網膜色素上皮細胞會喪失有效地降解感光廢料的功能，導致廢料在視網膜上堆積。功能不全的視網膜色素上皮細胞還會導致光感受器功能的退化，這會對視力造成極大的損傷。近20年來，組織工程學在眼科領域中的研究和應用，如角膜、結膜、淚腺及視網膜等方面，取得了令人矚目的成就。針對視網膜色素上皮細胞移植的研究工作也得到了一定程度的發展。目前，RPE種子細胞已經商品化，在這種研究背景下， 在受損的黃斑上移植RPE細胞這一種新穎的治療方法應運而生，開辟了治療年齡相關性黃斑變性的新途徑。由于RPE細胞重要的功能特性以及在AMD的發病中所起到的至關重要的作用，這一治療方法已經成為國內外學者關注的重大課題。但是到目前為止，科學家還沒有尋找到治療該疾病的有效方法。以視網膜色素上皮移植為基礎的眼組織工程研究的過程中，一些問題的出現阻礙了 AMD疾病治療方法的發展。主要表現在(1)離體培養的視網膜色素上皮細胞的功能性缺陷或者變異，尤其表現為易于老化，且無法有效地附著在視網膜上；( 移植的視網膜色素上皮細胞無法附著在視網膜中央窩上形成細胞層。研究表明，移植的視網膜色素上皮細胞必須重新貼附在一層基質上，才有可能在移植之后存活。因此尋找適宜視網膜色素上皮細胞離體擴增的細胞支架以維持視網膜色素上皮細胞的正常生理功能，成為解決上述問題的關鍵。
技術實現思路
為了克服上述現有技術存在的不足，本專利技術的目的在于提供一種促進視網膜色素上皮細胞擴增的水凝膠細胞支架的制備方法，由此制備方法制備出來的水凝膠細胞支架， 克服了易于老化，且無法有效地附著在視網膜上以及移植的視網膜色素上皮細胞無法附著在視網膜中央窩上形成細胞層的缺點，實現并促進人體視網膜色素上皮細胞能夠粘附、鋪展和增殖，可以起到防止其老化的功能。為了達到上述目的，本專利技術所采用的技術方案是—種，步驟如下步驟1 首先制備電解質高分子單體溶液，即將電解質高分子單體和溶劑按質量比范圍1 10 1 200混合而得電解質高分子單體溶液，溶劑為去離子水或PH值為 5. 7 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液，電解質高分子單體包括帶負電荷的丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸鈉、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、帶正電荷的丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、甲基丙烯酰氧乙基二甲基芐基氯化銨或者丙烯酰氧乙基二甲基芐基氯化銨；步驟2 制備中性高分子單體溶液，即將中性高分子單體和溶劑按質量比范圍 1 10 1 200混合而得中性高分子單體溶液，溶劑為去離子水或PH值為5. 7 8.0的磷酸鹽緩沖溶液，中性高分子單體包括甲基丙烯酸羥乙脂、甲基丙烯酸甲酯、N-乙烯基吡喏烷酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺或者N，N' 二甲基丙烯酰胺；步驟3 制備高分子水凝膠，即將制備而得的電解質高分子單體溶液與中性高分子單體溶液按電解質高分子單體與中性高分子單體的摩爾比范圍為1 0.05 1 1.0混合均勻后，加入質量濃度為1 10%的N，N'-亞甲基雙丙酰胺交聯劑和質量濃度為0. 1% 的2-氧代-1，5-戊二酸引發劑，其中電解質高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0. 1 1 0.5，而中性高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0.2 1 0.5，再次混合均勻后將該混合溶液在避光條件下利用氮氣脫氧30分鐘后加入板狀合成模具中，再用365nm的紫外燈對板狀合成模具內氮氣脫氧后的混合溶液在室溫下照射6小時后，再單體聚合為高分子水凝膠；步驟4 進行高分子水凝膠pH值和離子強度的調節，即將所得的高分子水凝膠在去離子水中浸泡，除去高分子水凝膠中微量的未反應單體、交聯劑及引發劑，然后將高分子水 疑月交用 4- (-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid ^ HEPES t^WMM 泡，該 HEPES 緩沖溶液還包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X 10_3g/l的苯酚紅，另外該HEPES緩沖溶液的離子強度I為0. 15M以及pH值為7. 4，并且每經過12小時更新一次所述的HEPES緩沖溶液，直到高分子水凝膠達到溶脹平衡，此時高分子水凝膠的離子強度和PH值與細胞培養液一致；步驟5:將達到溶脹平衡的高分子水凝膠切成直徑為15mm且厚度范圍為 1. 5mm-2mm的圓柱狀，在溫度為120°C條件下，經過20分鐘高壓滅菌之后轉移至培養板的孔中，這樣培養板和其上的高分子水凝膠就形成了促視網膜色素上皮細胞擴增的水凝膠細胞支架。所述的板狀合成模具是由玻璃板圍成的框架結構構成的容器，且該框架結構內設置有硅膠墊，其長寬高尺寸分別為10cm、IOcm以及0. Icm0本專利技術制備出來的水凝膠細胞支架克服了易于老化，且無法有效地附著在視網膜上以及移植的視網膜色素上皮細胞無法附著在視網膜中央窩上形成細胞層的缺點，實現并促進人體視網膜色素上皮細胞能夠粘附、鋪展和增殖，可以起到防止其老化功能的高分子水凝膠細胞支架。具體實施例方式下面結合實施例對本專利技術作更詳細的說明。實施例1 ，步驟如下步驟1 首先制備電解質高分子單體溶液，即將電解質高分子單體和溶劑按質量比范圍1 10混合而得電解質高分子單體溶液，溶劑為PH值為5. 7的磷酸鹽緩沖溶液，電解質高分子單體包括帶負電荷的丙烯酸；步驟2 制備中性高分子單體本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．一種促視網膜色素上皮細胞擴增的水凝膠細胞支架的制備方法，其特征在于，步驟如下：步驟１：首先制備電解質高分子單體溶液，即將電解質高分子單體和溶劑按質量比范圍１∶１０～１∶２００混合而得電解質高分子單體溶液，溶劑為去離子水或ｐＨ值為５．７～８．０的磷酸鹽緩沖溶液，電解質高分子單體包括帶負電荷的丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸鈉、２－丙烯酰胺基－２－甲基丙磺酸、帶正電荷的丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、甲基丙烯酰氧乙基二甲基芐基氯化銨或者丙烯酰氧乙基二甲基芐基氯化銨；步驟２：制備中性高分子單體溶液，即將中性高分子單體和溶劑按質量比范圍１∶１０～１∶２００混合而得中性高分子單體溶液，溶劑為去離子水或ｐＨ值為５．７～８．０的磷酸鹽緩沖溶液，中性高分子單體包括甲基丙烯酸羥乙脂、甲基丙烯酸甲酯、Ｎ－乙烯基吡喏烷酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺或者Ｎ，Ｎ′二甲基丙烯酰胺；步驟３：制備高分子水凝膠，即將制備而得的電解質高分子單體溶液與中性高分子單體溶液按電解質高分子單體與中性高分子單體的摩爾比范圍為１∶０．０５～１∶１．０混合均勻后，加入質量濃度為１～１０％的Ｎ，Ｎ′－亞甲基雙丙酰胺交聯劑和質量濃度為０．１％的２－氧代－１，５－戊二酸引發劑，其中電解質高分子單體和所述的Ｎ，Ｎ′－亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為１∶０．１～１∶０．５，而中性高分子單體和所述的Ｎ，Ｎ′－亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為１∶０．２～１∶０．５，再次混合均勻后將該混合溶液在避光條件下利用氮氣脫氧３０分鐘后加入板狀合成模具中，再用３６５ｎｍ的紫外燈對板狀合成模具內氮氣脫氧后的混合溶液在室溫下照射６小時后，再單體聚合為高分子水凝膠；步驟４：進行高分子水凝膠ｐＨ值和離子強度的調節，即將所得的高分子水凝膠在去離子水中浸泡，除去高分子水凝膠中微量的未反應單體、交聯劑及引發劑，然后將高分子水凝膠用４－（－２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１－ｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ的ＨＥＰＥＳ緩沖溶液浸泡，該ＨＥＰＥＳ緩沖溶液還包括５×１０－３Ｍ的ＨＥＰＥＳ、１．５５×１０－２Ｍ的ＮａＨＣＯ３、０．１４Ｍ的ＮａＣｌ以及２．５×１０－３ｇ／ｌ的苯酚紅，另外該ＨＥＰＥＳ緩沖溶液的離子強度Ｉ為０．１５Ｍ以及ｐＨ值為７．４，并且每經過１２小時更新一次所述的ＨＥＰＥＳ緩沖溶液，直到高分子水凝膠達到溶脹平衡，此時高分子水凝膠的離子強度和ｐＨ值與細胞培養液一致；步驟５：將達到溶脹平衡的高分子水凝膠切成直徑為１５ｍｍ且厚度范圍為１．５ｍｍ－２ｍｍ的圓柱狀，在溫度為１２０℃條件下，經過２０分鐘高壓滅菌之后轉移至培養板的孔中，這樣培養板和其上的高分子水凝膠就形成了促視網膜色素上皮細胞擴增的水凝膠細胞支架。...

【技術特征摘要】
1.一種促視網膜色素上皮細胞擴增的水凝膠細胞支架的制備方法，其特征在于，步驟如下步驟1 首先制備電解質高分子單體溶液，即將電解質高分子單體和溶劑按質量比范圍1 10 1 200混合而得電解質高分子單體溶液，溶劑為去離子水或PH值為5. 7 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液，電解質高分子單體包括帶負電荷的丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸鈉、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、帶正電荷的丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、甲基丙烯酰氧乙基二甲基芐基氯化銨或者丙烯酰氧乙基二甲基芐基氯化銨；步驟2:制備中性高分子單體溶液，即將中性高分子單體和溶劑按質量比范圍 1 10 1 200混合而得中性高分子單體溶液，溶劑為去離子水或pH值為5. 7 8.0的磷酸鹽緩沖溶液，中性高分子單體包括甲基丙烯酸羥乙脂、甲基丙烯酸甲酯、N-乙烯基吡喏烷酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺或者N，N' 二甲基丙烯酰胺；步驟3 制備高分子水凝膠，即將制備而得的電解質高分子單體溶液與中性高分子單體溶液按電解質高分子單體與中性高分子單體的摩爾比范圍為1 0.05 1 1.0混合均勻后，加入質量濃度為1 10%的N，N'-亞甲基雙丙酰胺交聯劑和質量濃度為0. 1% 的2-氧代-1，5-戊二酸引發劑，其中電解質高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0. 1 1 0.5，而中性高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0.2 1 0.5，再次混合均勻后將該混合溶液在避光條件下利用氮氣脫氧30分鐘后加入板狀合成模具中，再用365nm的紫外燈對板狀合成模具內氮氣脫氧后的混合溶液在室溫下照射6小時后，再單體聚合為高分子水凝膠；步驟4 進行高分子水凝膠pH值和離子強度的調節，即將所得的高分子水凝膠在去離子水中浸泡，除去高分子水凝膠中微量的未反應單體、交聯劑及引發劑，然后將高分子水凝月交用 4-(-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid 的 HEPES 緩沖溶液浸泡， 該 HEPES 緩沖溶液還包括 5X IO^3M 的 HEPESU. 55X IO^2M 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚紅，另外該HEPES緩沖溶液的離子強度I為0. 15M以及pH值為7. 4，并且每經過12小時更新一次所述的HEPES緩沖溶液，直到高分子水凝膠達到溶脹平衡，此時高分子水凝膠的離子強度和PH值與細胞培養液一致；步驟5 將達到溶脹平衡的高分子水凝膠切成直徑為15mm且厚度范圍為1. 5mm-2mm的圓柱狀，在溫度為120°C條件下，經過20分鐘高壓滅菌之后轉移至培養板的孔中，這樣培養板和其上的高分子水凝膠就形成了促視網膜色素上皮細胞擴增的水凝膠細胞支架。2.根據權利要求1所述的促視網膜色素上皮細胞擴增的水凝膠細胞支架的制備方法， 其特征在于所述的板狀合成模具是由玻璃板圍成的框架結構構成的容器，且該框架結構內設置有硅膠墊，其長寬高尺寸分別為10cm、IOcm以及0. Icm03.根據權利要求2所述的促視網膜色素上皮細胞擴增的水凝膠細胞支架的制備方法， 其特征在于，步驟如下步驟1 首先制備電解質高分子單體溶液，即將電解質高分子單體和溶劑按質量比范圍1 10混合而得電解質高分子單體溶液，溶劑為PH值為5. 7的磷酸鹽緩沖溶液，電解質高分子單體包括帶負電荷的丙烯酸；步驟2:制備中性高分子單體溶液，即將中性高分子單體和溶劑按質量比范圍1 10混合而得中性高分子單體溶液，溶劑為PH值為5. 7的磷酸鹽緩沖溶液，中性高分子單體包括甲基丙烯酸羥乙脂；步驟3 制備高分子水凝膠，即將制備而得的電解質高分子單體溶液與中性高分子單體溶液按電解質高分子單體與中性高分子單體的摩爾比范圍為1 0.05混合均勻后，加入質量濃度為1的N，N'-亞甲基雙丙酰胺交聯劑和質量濃度為0. 1%的2-氧代-1，5-戊二酸引發劑，其中電解質高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為 1 0. 1，而中性高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0.2，再次混合均勻后將該混合溶液在避光條件下利用氮氣脫氧30分鐘后加入板狀合成模具中， 再用365nm的紫外燈對板狀合成模具內氮氣脫氧后的混合溶液在室溫下照射6小時后，再單體聚合為高分子水凝膠；步驟4 進行高分子水凝膠pH值和離子強度的調節，即將所得的高分子水凝膠在去離子水中浸泡，除去高分子水凝膠中微量的未反應單體、交聯劑及引發劑，然后將高分子水凝月交用 4-(-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid 的 HEPES 緩7中溶液浸泡， 該 HEPES 緩沖溶液還包括 5X KT3M 的 HEPESU. 55X KT2M 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚紅，另外該HEPES緩沖溶液的離子強度I為0. 15M以及pH值為7. 4，并且每經過12小時更新一次所述的HEPES緩沖溶液，直到高分子水凝膠達到...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳詠梅，劉健康，馮智輝，劉振齊，
申請(專利權)人：西安交通大學，
類型：發明
國別省市：87