一種抗菌肽A及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種抗菌肽A，它的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發明專利技術還公開了所述抗菌肽A在制備抗菌藥物中的應用，實驗顯示：本發明專利技術所述抗菌肽A對革蘭氏陽性菌或是革蘭氏陰性菌都有很好地抑制作用，而且對真菌的抑制作用也很明顯。提示其在抗菌藥物開發和應用方面有重要價值。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種抗菌肽，尤其涉及一種具有顯著抑菌活性的抗菌肽A及其應用。
技術介紹
目前，由于抗菌藥物的廣泛使用，使多數的常規抗生素都出現了相應的耐藥性致病株系，因而尋找全新類型的抗菌藥物成為解決耐藥性問題的又一課題。抗菌肽是對多種微生物、病毒、原蟲甚至癌細胞都有明顯抑殺作用的小分子多肽， 廣泛存在于生物體內。與抗生素不同，抗菌肽是特定基因編碼的產物，它通過破壞細胞膜通透性使細胞內容物外流，最終導致細菌死亡，其抑菌過程中細菌不易產生耐藥性，因此抗菌肽非常有望成為替代抗生素的新型抗菌藥物。近年來，多肽在人體中的作用已越來越多的被科學界發現，其產生的醫藥效果也引起了人們的高度重視。因此，開發具有診斷、監測、預防和治療藥作用的多肽藥物的研究成為迫切任務。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種具有顯著抑菌活性的抗菌肽A及其應用。本專利技術所述的抗菌肽A，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。具體的氨基酸序列描述是:Leu Val Val Leu Ala Leu lie Leu Ala Val lie Ser Asp Ser His Ala Lys0本專利技術提供的抗菌肽A不需任何修飾連接，且人工合成方便；試驗證明具有顯著的抑菌功能，同時對正常細胞無毒性。本專利技術所述抗菌肽A在制備抗菌藥物中的應用。功能實驗顯示本專利技術所述抗菌肽A抗菌譜很廣，無論是G+菌(革蘭氏陽性菌)、 還是G菌(革蘭氏陰性菌)，都能被它很好地抑制，而且對真菌的抑制作用也很明顯。提示其在抗菌藥物開發和應用方面有重要價值。進一步的功能實驗顯示本專利技術的抗菌肽A對細菌的抑制作用在IOmin之內就開始發揮，20min后抑制率即可達80%，45min后就可達到90%以上。鑒于上述多肽的性質和功能，本領域普通技術人員可以利用分子生物學技術，根據氨基酸與密碼子的對應關系反推出核酸序列作為功能基因，用于制備轉基因動物、植物或工程菌以表達功能蛋白，并用于藥物的開發和臨床治療。具體實施例方式實施例1本專利技術所述抗菌肽A的設計與合成1、依據目前國際主要抗菌肽數據庫(http //www. imtech. res. in/raghava/ antibp/ ；http//aps.unmc. edu/AP/main. php ；http//www. bbcm. univ. trieste. it/ ； http://penbase. immunaqua. com/)中登陸的抗菌肽的序列，分析其一級結構與活性的關系的對應關系，設計人工多肽序列。2、利用蛋白質分析數據庫http://WWW. expasy. org/分析已知活性的多肽序列與設計的多肽序列的二級結構的相似度，結合其它物理化學參數預測進行設計序列的修正。3、將設計的人工多肽序列(抗菌肽)送至生物公司合成或利用自動多肽合成儀合成序列。HPLC檢測純度要大于96%，同時通過質譜檢測確定多肽合成質量。樣品以凍干狀態保存。4、合成后的多肽進行抑菌功能檢測篩選。5、通過功能檢測，最終獲得具有抑菌功能的多肽序列——抗菌肽A，其氨基酸序列具體信息是(a)序列特征*長度17氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓撲結構線性(b)分子類型蛋白質(C)序列描述Leu Val Val Leu Ala Leu lie Leu Ala Val lie Ser Asp Ser His Ala Lys0實施例2利用液體生長抑制法檢測本專利技術所述抗菌肽A的抑菌活性2. 1材料、試劑1)本專利技術所述抗菌肽A由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，氨芐青霉素 (Amp)為solarbio公司產品，一次性濾器，為美國PALL公司產品，其它藥品試劑為國產分析純。2)選用革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subti lis (Ehrenberg) Cohn)、 金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、藤求菌(Sarcina ureae)、蘇云金芽子包桿菌(Bacillus thuringiensis) > 巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)；革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichia coli)、 弧菌(Vibrio)、肺炎克氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、變形桿菌(Proteus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)；真菌病鐮刀菌(Fusarium solani)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、瓜類炭疽病菌 (Colletetrichum lagenarium)、蘋果炭疽病菌(Gloeosporium album)棉花黃萎病菌 (Verticillium dahliae)進行測試。3)封閉液0. 4% BSA(w/v),0. 02%冰醋酸，配制后過濾除菌。4) PB 液體培養基(PH 7. 4-7. 6)胰蛋白胨(Tryptone)10g/L氯化鈉(NaCl)5g/L2. 2 實驗1)向無菌96孔酶標板所使用的孔中加入200 μ L封閉液，室溫封閉Mh。2)用PB液體培養基過夜培養上述各種細菌，轉培養使細菌處于對數生長期。用PB培養基調整菌液0D_約為0. 005。3)酶標板棄去封閉液，每孔加90 μ L步驟2、所述菌液，再加入用10 μ L無菌水配好的各種濃度梯度(濃度范圍20mg/mL 80mg/mL)的本專利技術所述抗菌肽Α。陰性對照為 90 μ L菌液+10 μ L無菌水；陽性對照為90 μ 1菌液+10 μ L濃度為0. 25mg/mL氨芐青霉素溶液(終濃度為0. 025mg/mL,約62 μ M)。4)將加好菌液和藥品的酶標板置于搖床，IOOrpm恒溫培養。分別在培養后 0. 5h、3h、12h、15h、24h、36h，用 BIOTEK ELX800 酶標儀測定每孔的 630nm 吸光值(OD630)。5)利用SigmaplotlO和Excel軟件分析處理數據。結果表明，本專利技術的抗菌肽A對G+菌、或是對G_菌都具有明顯的抑制作用，并且對真菌也有抑制作用；35mg/mL 70mg/mL濃度范圍內，濃度越大抑菌效果越明顯。提示其在抗菌藥物開發和應用方面有重要價值。實施例3以大腸桿菌(Escherichia coli)為指示菌。質量濃度為65mg/mL的本專利技術抗菌肽A，分別在作用大腸桿菌(Escherichia coli) IOmin, 25min, 45min, 60min 禾口 90min 后涂板。大腸桿菌抑制曲線顯示本專利技術的抗菌肽A對細菌的抑制作用在IOmin之內就開始發揮，20min后抑制率即可達80%，45min后就可達到90%以上。權利要求1.一種抗菌肽A，其特征在于所述抗菌肽A的氨基酸序列描述是Leu Val Val LeuAla Leu lie Leu Ala Val lie Ser Asp Ser His Ala Lys ；以 SEQ ID NO. 1 所示。2.權利要求1所述抗菌肽A在制備抗菌藥物中的應用。3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述細菌是革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陰性本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．一種抗菌肽Ａ，其特征在于：所述抗菌肽Ａ的氨基酸序列描述是：Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ＬｅｕＡｌａ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ；以ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張尚立，張恒，常宏文，馬劍峰，王麗，王萍，
申請(專利權)人：山東大學，
類型：發明
國別省市：88