含有抗血凝素抗體、保守的流感抗原和免疫刺激載體結合結構域的多功能連接子蛋白制造技術

本發明專利技術涉及免疫學和疫苗領域。具體而言，本發明專利技術涉及蛋白質物質及其在對抗由呼吸道病原體引起的感染的疫苗中的應用。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及免疫學和疫苗領域。具體而言，本專利技術涉及蛋白質物質及其在對抗 由呼吸道病原體引起的感染的疫苗中的應用。
技術介紹
流感病毒是一種世界范圍內的最重要的呼吸道病原體之一。流感病毒在季節性 流行期間通常感染全世界總人口的10% 20%，產生三 五百萬的嚴重病例并導致每年 250,000 500,000例死亡。在美國，每年流感要奪去平均20,000人的生命，而同時平均 114,000例流感相關的住院治療導致每年$120億的估計經濟損失。而且，新型流感菌株 也偶爾出現在人群中，導致大范圍流行。1917 1920年西班牙流感流行的死亡人數導致 全世界超過了 5000萬例死亡，而新型流感流行的危險一直存在?？刂屏鞲械淖罴逊绞绞?接種疫苗。然而，相對于針對許多其它病原體在一生中僅接種1 3次的疫苗，流感疫 苗需要每年給予。流感表現出改變其兩個主要膜蛋白，血凝素(HA)和神經氨酸苷酶(NA)的抗原 特性的非凡能力。這通過遠離人群中所建立的適應性免疫響應的連續選擇而產生。由于 病毒的高突變率，特定的疫苗制劑通常僅僅有效約1年。世界衛生組織每年調整疫苗的 內容物以包含下一年發作的最可能的病毒菌株?，F在，傳統疫苗是由三種非活化的流感 病毒(兩個A-鏈和一個B鏈)組成的疫苗。這三價流感疫苗是基于WHO預測的在即將 來臨的流感季節流行的流感菌株每年重新制作的。例如，對于2007 2008季的年更新 三價流感疫苗由來自流感H3N2、HlNl和B流感病毒的血凝素(HA)表面糖蛋白組分組 成。流感疫苗的劑量根據其HA內容物、病毒的主要糖蛋白確定。每年生產超過二 億五千萬劑的流感疫苗，在60% 80%范圍內的兒童和老人中發揮保護效果。因此，對 于改進的流感疫苗尤其是在易感目標人群如兒童和老人中仍存在某些需要未滿足。改進 流感疫苗的當前方法包括a.引入佐劑；b.引入其它流感抗原組分；C.在體內的病毒進入處引發局部免疫反應的方法，由此提供疫苗的外部防御 線。流感疫苗現在來自于在含胚雞蛋或組織培養中生長的病毒。大多數流感疫苗包 含減毒的活病毒、滅活病毒、裂解病毒(split virus)或HA亞單位。新技術正在出現，例 如通過采用昆蟲細胞生產HA亞單位物質。一個增強疫苗組分尤其是亞單位疫苗的免疫 原性的常見方式，是加入佐劑。通常也認為，疫苗組分(抗原)共價或非共價吸附或連 接至佐劑是有利的。鋁鹽(Alum)是人類疫苗中適于此目的的最常用佐劑。然而，吸附 于鋁鹽上的流感疫苗是有毒，因此批準的人用流感疫苗主要是無佐劑的。迄今為止，對抗流感還沒有可用的廣譜疫苗。另外，盡管與季節性流感爆發相 關的發病率和死亡率很高，在許多國家人群中的接種覆蓋率卻較低。能夠得到提供比每 年度的流感疫苗對流感更廣譜的保護的流感疫苗，更具吸引力并因此有助于流感疫苗的 增效和/或使用。另外，無論亞型如何，有效對抗多種人類流感病毒A菌株的疫苗可以 考慮用于作為對新型流感流行預防的儲備。
技術實現思路
因此，本專利技術的一個目的是提供改進的流感疫苗。具體而言，本專利技術人的目的 在于提供適用于人的有佐劑的流感疫苗，其提供對抗非疫苗型流感類型的交叉保護。優 選新疫苗的分子設計能夠進行方便的和成本有效的年度重新配制。至少一些這樣的目的通過開發含有不易突變的流感抗原組分的多功能多肽而被 滿足，所述多肽進一步能夠“負載”上各種HA亞型多樣性和被固定或連接至免疫刺激 載體上的多肽。因此，本專利技術提供了一種蛋白質物質，含有(i)至少一個能夠非共價結合至HA 的多抗原亞型的血凝素(HA)結合結構域(HBD)，(ii)保守的流感蛋白、或其抗原片段， 和(iii)免疫刺激載體結合結構域(IBD)。優選地，抗原片段能夠通過主要的組織相容性 復合物(MHC)I類或II類提供。因此，該片段將典型地具有至少約6或7個氨基酸殘基 的長度。本專利技術還提供了編碼該蛋白質物質的核酸序列和含有該核酸序列的宿主細胞。 其它實施方式涉及(通過其IBD)連接至免疫刺激載體的蛋白質物質和含有用HA亞型負 載的多種物質(例如，抗體片段)的載有抗原的免疫刺激載體。正如本文中所公開的蛋白 質物質容許易于將具有佐劑活性的免疫刺激載體加載到不同的HA亞型，而不會改變HA 抗原生產工藝過程，與此同時提供對抗其它菌株的更廣譜(交叉的)保護。蛋白質物質 也稱之為‘多功能蛋白錨定(縮寫為‘Protan’)連接子’。在本專利技術的蛋白質物質中，不同結構域的相對位置能夠變化。所述結構域能夠 直接相互融合或它們可以通過間隔區序列間隔。典型地，保守流感病毒(膜)蛋白或其 抗原片段(或其多個拷貝；參見以下內容)將會側接于HBD的一側并通過IBD側接于另 一側，而使HBD和IBD易于接近其結合伴侶(分別是HA抗原和免疫刺激載體)。在一 個實施方式中，至少一個HBD和IBD分別位于所述蛋白質物質的C-端和N-端。在另 一實施方式中，至少一個HBD和IBD分別位于該蛋白質物質的N-端和C-端。該結構 域并沒有必要位于該蛋白質物質的最外端；一段一個或多個氨基酸殘基能夠存在于該物 質既不是HBD也不是IBD的任意一端。在優選的實施方式中，該蛋白質物質的HA-結合結構域能夠結合至多個源于流 感病毒A型和/或B型的HA亞型。典型的HA亞型包括HA1、HA2、HA3、HA4、 HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HAl0, HAlU HAl2, HAl3, HA14、HAl5 和 HA16。在一個實施方式中，HA-結合結構域能夠識別特異于季節性流感的亞型，例如， HAl和HA3。在另一實施方式中，其識別特異于流行性流感的多個亞型，如HA5、HA7 和 HA9。流感HA亞型合適的結合結構域能夠通過多個方式獲得i.通過免疫小鼠選擇抗體，選擇顯示出對HA亞型廣譜結合的單克隆，確定可變的結構域氨基酸序列；ii.使用抗體噬菌體展示文庫選擇顯示結合多個HA亞型的scFv或納米抗體 (nanobodies)；iii.文獻中描述的具有已知結合譜和所述可變區的已知氨基酸序列的抗體。因此，本專利技術一方面提供了包含(i)能夠結合至HA的多抗原亞型抗體或其功能 片段，Gi)保守流感蛋白、或其抗原片段，和(iii)免疫刺激載體結合結構域(IBD)的蛋 白質物質。例如，HA結合結構域是由通過間隔區連接的可變輕鏈結構域(VL)和可變重鏈 結構域(VH)組成的單鏈抗體(scFv)。可以使用任何類型的間隔區序列，條件是其并不 包含潛在的蛋白裂解位點且可以具有充分的柔性以正確地定位VL和VH結構域從而獲得 功能性scFv。連接VH和VL的合適間隔區是間隔區218 (Whitlow, M et al.l993.Protein Eng.6 989-995)。Watabe, T et al. (2007 ； Mol.Biol.Evol.24 1627-1638)，描述了結合至 HA 的具有已知的3D結構的四種小鼠單克隆抗體。兩種抗體結合至HA受體結合區域的稍微不同 的表位(單克隆HC 19和HC63，結構2VIR.PDB和1KEN.PDB)并且結合到HA側更近 膜區域上的一個表位的兩個抗體并不涉及受體結合(HC45和BH151，結構IQF U.PDB和 1E08.PDB)。根據作者，抗體HC45本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種蛋白質物質，包含：（ｉ）至少一個能夠非共價結合至ＨＡ的多抗原亞型的血凝素（ＨＡ）結合結構域（ＨＢＤ），（ｉｉ）保守的流感蛋白、或其抗原片段，和（ｉｉｉ）免疫刺激載體結合結構域（ＩＢＤ）。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：科內利斯約翰內斯林豪特施，馬爾藤萊昂納德斯范羅斯馬倫，戈韋爾特約翰施奧藤，
申請(專利權)人：繆科西斯私人有限公司，
類型：發明
國別省市：NL