本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種融合蛋白Ｔｒｘ－ＴＡＴ－ｈＭｓｒＡ的制備方法及其在神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)方面的應(yīng)用。融合蛋白Ｔｒｘ－ＴＡＴ－ｈＭｓｒＡ含有ＴＡＴ蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和硫氧還原蛋白Ｔｒｘ，以及人源性蛋氨酸亞砜還原酶ｈＭｓｒＡ。本發(fā)明專利技術(shù)的融合蛋白具有還原功能性蛋白蛋氨酸殘基氧化、治療氧化應(yīng)激損傷、減緩帕金森癥相關(guān)神經(jīng)元病變、防治鈣離子超載等多種生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)其具有很好的透過細(xì)胞膜進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞的能力，是一種成藥性好的新型生物技術(shù)候選藥物。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬基因工程
，具體涉及一種融合有TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和人源性 蛋氨酸亞砜還原酶hMsrA以及硫氧還原蛋白Trx所形成的融合蛋白(重組Trx-TAT-hMsrA 融合蛋白)，及其制備方法和在神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)方面的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
大量現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)研究表明，氧自由基介導(dǎo)的病理損傷參與多種神經(jīng)系統(tǒng)重大疾 病的發(fā)生和發(fā)展。腦部豐富的脂質(zhì)含量和相對缺乏的抗氧化酶水平使其在氧化應(yīng)激中更易 受損。多種因素(如異常折疊蛋白積聚、缺血再灌注損傷等)通過線粒體有氧呼吸等途徑誘 導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生更多的活性氧(R0S)，如02_.、Η202、0Η·和1O2,而衰老過程中常伴有ROS清除系 統(tǒng)(如谷胱甘肽還原系統(tǒng)、超氧化物歧化酶等)的減弱，從而導(dǎo)致氧自由基或氧化產(chǎn)物的異 常積累，引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病的發(fā)生。蛋白質(zhì)是大多數(shù)細(xì)胞生理活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，氧自由 基對于功能性蛋白如離子通道、酶以及受體等的氧化修飾，往往會導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的失活、 異常甚至蛋白質(zhì)的降解加劇，從而介導(dǎo)細(xì)胞生理功能的紊亂。蛋白質(zhì)分子中最易受到攻擊 的是含硫氨基酸殘基，包括半胱氨酸殘基(cysteine，Cys)和蛋氨酸(methionine，Met)殘 基，Cys的氧化產(chǎn)物包括次磺酸基二硫化物和磺基，通常以二硫化物為主。體內(nèi)存在硫氧還 原蛋白等還原性物質(zhì)或體外存在DTT時(shí)，二硫鍵易被還原成巰基。半胱氨酸殘基氧化形成 二硫鍵，會影響包括L型鈣離子通道、谷氨酸受體等神經(jīng)系統(tǒng)重要蛋白的功能，申請者所在 實(shí)驗(yàn)室的大量研究表明，使用巰基還原性藥物逆轉(zhuǎn)還原這種變化，可以治療衰老相關(guān)的突 觸功能損傷。蛋氨酸殘基氧化是蛋白質(zhì)功能氧化性損傷另一個(gè)關(guān)鍵誘導(dǎo)因素。在弱氧化劑 作用下，蛋氨酸易被氧化成MetO，在更強(qiáng)氧化劑如Ch-T的作用下，可進(jìn)一步氧化成Met02。 MetO可由蛋氨酸還原酶還原成Met，但Met02非常穩(wěn)定，生理?xiàng)l件下不能被還原。從結(jié)構(gòu)上 看，正常蛋氨酸側(cè)鏈很長，有彈性，無極性。氧化成MetO后，側(cè)鏈變得僵硬，極性變大，從而 使整個(gè)蛋白質(zhì)功能改變。國外大量實(shí)驗(yàn)室的研究表明，關(guān)鍵蛋白質(zhì)的蛋氨酸殘基氧化，和多 種神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。申請者所在實(shí)驗(yàn)室的大量研究表明，蛋白質(zhì)蛋 氨酸殘基的氧化修飾和離子通道功能異常、突觸可塑性損傷以及細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡都有著密 切關(guān)系。因此，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)蛋氨酸殘基的氧化，可能成為治療神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病的新策略。蛋氨酸亞砜還原酶A (methionine sulfoxide reductase A, MsrA)是目前發(fā)現(xiàn)的 可在生物體內(nèi)還原逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)蛋氨酸殘基氧化結(jié)構(gòu)變化和功能損傷的主要抗氧化酶系統(tǒng)。 MsrA在很多生物體中，從進(jìn)化上非常古老的古細(xì)菌大腸桿菌到植物和哺乳動物中均有發(fā) 現(xiàn)，其抗氧化作用對于生物體的生存具有特別重要的意義。大量研究表明，MsrA是一種存 在于生物體中的抗氧化修復(fù)因子。過表達(dá)MsrA基因可以顯著減輕氧化應(yīng)激引起的人T細(xì) 胞、人Lens細(xì)胞、PC12細(xì)胞和WI-38SV40等細(xì)胞的損傷和凋亡。有研究認(rèn)為，MsrA與衰老 及哺乳動物壽命密切相關(guān)。因此，調(diào)節(jié)MsrA的基因表達(dá)，為治療多種氧化相關(guān)的病理疾病 提供了全新的視角和技術(shù)手段。而硫氧還原蛋白(Trx)是一種低分子量、進(jìn)化上高度保守3的有還原二硫鍵氧化產(chǎn)物活性的蛋白質(zhì)，主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞胞內(nèi)氧化還原平衡，參與氧 應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。它既是MsrA系統(tǒng)在體內(nèi)發(fā)揮功能最重要的伴侶分子，同時(shí)也是還原 體內(nèi)半胱氨酸殘基氧化最重要的功能分子，我們設(shè)想，通過基因重組的方法，制備一種MsrA 和Trx的融合蛋白。在神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病中，許多疾病和氧化損傷及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，包 括帕金森綜合癥、缺血性腦損傷、老年癡呆癥、血管性癡呆等。應(yīng)用這種融合蛋白，在這些疾 病的治療中可能起到重要的作用。蛋氨酸亞砜還原酶A (MsrA)和硫氧還原蛋白(Trx)從本質(zhì)上講都是功能性蛋白， 可以按照基因工程的方法進(jìn)行制備。但是，蛋白質(zhì)類生物技術(shù)藥物很難進(jìn)入細(xì)胞，外周給藥 也很難透過血腦屏障。為了克服蛋白質(zhì)藥物的這些成藥性差的缺點(diǎn)，研制能夠用于中樞神 經(jīng)系統(tǒng)疾病的新型生物技術(shù)藥物，我們設(shè)想通過基因重組改造作為功能性蛋白的MsrA和 Trx0 HIV-I病毒是一種具有很強(qiáng)穿透細(xì)胞和進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)能力的蛋白質(zhì)顆粒，其進(jìn)入 細(xì)胞和進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域是其Tat蛋白第49-57位氨基酸。這種Tat蛋白來 源的穿膜結(jié)構(gòu)域小肽，在運(yùn)載蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞方面已經(jīng)表現(xiàn)出極強(qiáng)的應(yīng)用前景。我們設(shè)想 通過基因工程方法，將Tat蛋白來源的穿膜結(jié)構(gòu)域小肽、人源性蛋氨酸亞砜還原酶A蛋白以 及硫氧還原蛋白構(gòu)建成融合蛋白，從而將來用于制備治療神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病相關(guān)藥物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種融合蛋白，使其具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。本專利技術(shù)的另一個(gè)任務(wù)是提供該融合蛋白的制備方法和應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)的技術(shù)方案是本專利技術(shù)提供的這種融合蛋白由硫氧還原蛋白Trx和TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及人源 性蛋氨酸亞砜還原酶hMsrA組成，本專利技術(shù)專利申請將該融合蛋白稱為重組Trx-TAT-hMsrA 融合蛋白。本專利技術(shù)提供的重組Trx-TAT-hMsrA融合蛋白，一共416個(gè)氨基酸，其中1-109位氨 基酸是Trx蛋白，110-165位氨基酸是連接區(qū)，166-179位氨基酸是TAT蛋白，180-416位氨 基酸是hMsrA蛋白。本專利技術(shù)提供的重組Trx-TAT-hMsrA融合蛋白有如SEQ ID NO :1所示的 氨基酸序列，分子量為45KD。重組Trx-TAT-hMsrA融合蛋白包含三個(gè)功能區(qū)，每個(gè)功能區(qū)的功能如下Trx主要 功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞胞內(nèi)氧化還原平衡；TAT蛋白是一個(gè)富含堿性氨基酸的多肽片段，主要功 能是引導(dǎo)重組Trx-Tat-hMsrA融合蛋白穿透細(xì)胞膜；人源性蛋氨酸亞砜還原酶hMsrA是體 內(nèi)唯一可以還原蛋白質(zhì)蛋氨酸殘基氧化的還原酶，主要功能是修復(fù)蛋白質(zhì)氧化性損傷。由 于許多疾病和氧化損傷密切相關(guān)，包括帕金森綜合癥、缺血性腦損傷、老年癡呆癥、血管性 癡呆等，本專利技術(shù)重組Trx-TAT-hMsrA融合蛋白可用于這些疾病的治療。實(shí)驗(yàn)資料一本專利技術(shù)專利申請實(shí)施例1提供了本專利技術(shù)重組Trx-TAT-hMsrA融合蛋白的制備方 法。實(shí)驗(yàn)資料一提供本專利技術(shù)重組Trx-TAT-hMsrA融合蛋白鑒定資料。1.重組 Trx-TAT-hMsrA 融合蛋白的 Western blot 鑒定融合蛋白做Western blot檢測鑒定試驗(yàn)。電泳條件和實(shí)施例二保持一致。按表 三配制轉(zhuǎn)移緩沖液。按表四配制TBST緩沖液。電泳結(jié)束后，根據(jù)蛋白market切出目的蛋白位置(45KD)左右的膠，與NC膜、濾紙一起浸入轉(zhuǎn)膜液中平衡至少15分鐘。按著負(fù)極，海 綿，濾紙，膠，NC膜，濾紙，海綿，正極的順序?qū)⑵浞湃朕D(zhuǎn)膜盒中，恒流濕轉(zhuǎn)法將蛋白從膠轉(zhuǎn)移 至NC膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜浸沒在封閉液中(5%去脂奶粉溶于TBST)中封閉1小時(shí)， 將NC膜置于適當(dāng)濃度的一抗(1%去脂奶粉溶于TBST配制)中，4°C振蕩孵育過夜。TBST 充分漂洗后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫下振蕩孵育1小時(shí).TBST充分漂洗后，ECL熒光劑， 5分鐘，根據(jù)熒光強(qiáng)度，適當(dāng)曝光壓片顯影.膠片掃描后，用本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳建國，曾建華，吳鵬飛，王芳，張醉，楊遠(yuǎn)堅(jiān)，
申請(專利權(quán))人：華中科技大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：83
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