一種用于預防兔斯氏艾美耳球蟲病的鐵蛋白納米顆粒疫苗及制備方法技術

本發明專利技術提供一種用于預防兔斯氏艾美耳球蟲病的鐵蛋白納米顆粒疫苗及制備方法，采用鐵蛋白納米顆粒作為疫苗的載體，制備預防斯氏艾美耳球蟲病亞單位的疫苗，疫苗的穩定性和免疫原性大幅提高；納米技術實現疫苗的靶向遞送，使疫苗更精準地作用于免疫細胞，提高免疫應答水平，具有成本低、安全性高、具有很好保護效果等優點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術提供了一種用于預防兔斯氏艾美耳球蟲病的鐵蛋白納米顆粒疫苗及制備方法，該疫苗可用于預防兔的斯氏艾美耳球蟲病，屬于生物。

技術介紹

1、斯氏艾美耳球蟲（ eimeria?stiedae）病是由艾美耳屬的球蟲寄生于兔肝臟膽管上皮細胞引起的一種嚴重的原蟲病，是致病性最強且危害最大的球蟲病之一。目前，斯氏艾美耳球蟲的防控主要依賴于藥物治療，如地克珠利、氯苯胍、復方新諾等，但是容易出現耐藥蟲株和藥物殘留問題。

2、斯氏艾美耳球蟲的生活史包括兩個階段，內生發育階段（裂殖生殖和配子生殖），外生發育（孢子生殖）。其中子孢子和裂殖子對肝臟膽管上皮細胞的入侵是早期造成肝臟損傷的主要原因。球蟲入侵宿主機制相對保守，子孢子和裂殖子依賴于蟲體頂端特殊的分泌器官（微線體、棒狀體、致密顆粒）分泌的一系列入侵相關蛋白，以獨特的滑移運動方式進行。例如微線體蛋白(mic?)和頂膜抗原(ama)、棒狀體蛋白(ron、rop)、致密顆粒蛋白（gra）等。在目前已經確定的原蟲抗原中，棒狀體蛋白被認為是一種有前途的疫苗抗原。尤其在弓形蟲上，其參與蟲體入侵過程、調控宿主細胞。因此，rops有望成為包含球蟲在內的頂復門原蟲疫苗的候選抗原。目前斯氏艾美耳球蟲在弱毒疫苗、亞單位疫苗和弱毒疫苗上有著廣泛研究。但尚未有商業化的產品，仍需要進一步的研究和臨床試驗來驗證其安全性和有效性。因此研發一種成本低、安全性高、保護效果好的疫苗顯得尤為重要。

3、鐵蛋白（ferritin）納米顆粒是由24個相同亞基自組裝成的近球形蛋白結構，外徑大約12nm，內徑8nm，目前作為疫苗遞送系統已經被廣泛應用。而spytag/spycatcher（st/sc）是一種新型的蛋白質連接系統，spytag可以與spycatcher在幾分鐘內形成一種穩定的共價結合形式，這種結合具有高度的特異性和親和力，并且不易受溫度和ph的影響。將spycatcher融合到鐵蛋白的n端，將spytag融合到抗原蛋白的n端。通過spytag/spycatcher的連接反應，可以將抗原蛋白穩定的展示在鐵蛋白表面，構建出一種基于鐵蛋白納米顆粒的疫苗遞送系統。

技術實現思路

1、本專利技術設計了一種用于預防兔斯氏艾美耳球蟲病的鐵蛋白納米顆粒疫苗及制備方法，為一種能夠展示斯氏艾美耳球蟲rop38蛋白的鐵蛋白納米顆粒疫苗。

2、本專利技術所述的一種鐵蛋白納米顆粒sc-fn，其中鐵蛋白的n端融合有136個氨基酸的spycatcher短肽，其序列如：seq?id?no.1所示。

3、本專利技術所述的一種斯氏艾美耳球蟲重組蛋白st-rop38，?rop38的n端融合有13個氨基酸的spytag標簽短肽，其序列如：seq?id?no.2所示。

4、本專利技術所述的一種斯氏艾美耳球蟲的自組裝納米顆粒疫苗，包含上述的鐵蛋白納米顆粒sc-fn和上述的斯氏艾美耳球蟲重組蛋白st-rop38；這兩部分在緩沖液（50mm?tirs;150mm?nacl;?ph=8.0）環境中，通過共價結合方式組裝成為st-rop38/sc-fn納米顆粒，可以將rop38蛋白展示在鐵蛋白納米顆粒表面。

5、本專利技術所述的一種用于預防兔斯氏艾美耳球蟲病的鐵蛋白納米顆粒疫苗的制備方法，包括以下步驟：

6、1）將sc序列通過柔性linker(ggggs)4串聯至fn序列的n端，并構建至原核表達載體中，利用大腸桿菌表達系統進行誘導表達與純化；所述表達載體為pet28a，所述感受態細胞為bl21；

7、2）將st序列利用柔性linker(ggggs)4串聯至斯氏艾美耳球蟲抗原rop38序列的n端，并構建至原核表達載體中，利用大腸桿菌表達系統進行誘導表達和純化；所述表達載體為pet28a，所述感受態細胞為bl21；

8、3）將純化的st-rop38和sc-fn按照1：4的摩爾比例，在4℃的溫度和緩沖液（50mmtirs;?150mm?nacl;?ph=8.0）中進行組裝并純化，并對制備的st-rop38/sc-fn納米顆粒大小和形態進行表征；

9、4）提供st-rop38和sc-fn所述表達載體為pet28a-st-rop38和pet28a-sc-fn，所述重組菌株為bl21細胞；

10、5）取100?μg的?st-rop38/sc-fn與300?μg氫氧化鋁佐劑溶于1ml無菌pbs，制成rop38蛋白的納米顆粒疫苗，儲存于-20℃保存。

11、本專利技術的積極效果在于：采用鐵蛋白納米顆粒作為疫苗的載體，制備預防斯氏艾美耳球蟲病亞單位的疫苗，疫苗的穩定性和免疫原性大幅提高；納米技術實現疫苗的靶向遞送，使疫苗更精準地作用于免疫細胞，提高免疫應答水平，具有成本低、安全性高、具有很好保護效果等優點。

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【技術保護點】

1.一種鐵蛋白納米顆粒SC-FN，其特征在于：其中鐵蛋白的N端融合有114個氨基酸的SpyCatcher短肽，其序列如SEQ?ID?NO?.1所示。

2.一種斯氏艾美耳球蟲重組蛋白ST-ROP38，其特征在于：ROP38的N端融合有13個氨基酸的SpyTag標簽短肽，其序列如SEQ?ID?NO?.2所示。

3.一種斯氏艾美耳球蟲的自組裝納米顆粒疫苗，其特征在于：包含權利要求1所述的鐵蛋白納米顆粒SC-FN和權利要求2所述的斯氏艾美耳球蟲重組蛋白ST-ROP38；這兩部分在緩沖液（50mM?Tirs;?150mM?NaCl;?pH=8.0）環境中，通過共價結合方式組裝成為ST-ROP38/SC-FN納米顆粒，將ROP38蛋白展示在鐵蛋白納米顆粒表面。

4.一種用于預防兔斯氏艾美耳球蟲病的鐵蛋白納米顆粒疫苗的制備方法，包括以下步驟：

【技術特征摘要】

1.一種鐵蛋白納米顆粒sc-fn，其特征在于：其中鐵蛋白的n端融合有114個氨基酸的spycatcher短肽，其序列如seq?id?no?.1所示。

2.一種斯氏艾美耳球蟲重組蛋白st-rop38，其特征在于：rop38的n端融合有13個氨基酸的spytag標簽短肽，其序列如seq?id?no?.2所示。

3.一種斯氏艾美耳球蟲的自組裝納米顆粒疫苗，其特征在于：...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李建華，李超凡，李新，李亞歡，王曉岑，張旭，陳夢閣，宮鵬濤，張楠，張西臣，
申請(專利權)人：吉林大學，
類型：發明
國別省市：