【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及毒素檢測，尤其涉及一種基于lc-ms/ms的相思子毒素活性的檢測方法。
技術(shù)介紹
1、相思子毒素(abrin?toxin，at)是一種來源于豆科藤本植物相思子的植物毒素，分子量約為60-65kda，等電點在6-8之間，是由一條具有n-糖苷酶活性a鏈和一條具有半乳糖特異性的b鏈組成，它們通過二硫鍵連接在一起，b鏈介導(dǎo)a鏈進(jìn)入細(xì)胞，a鏈發(fā)揮n-糖苷酶活性，特異性的切割核糖體28rrna第4324的位點上的腺嘌呤，導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活，從而發(fā)揮毒性作用。at分為a、b、c、d四個亞型，其中a亞型的細(xì)胞毒性最強(qiáng)且含量最高。at可通過不同的感染途徑進(jìn)入人體引起中毒，包括呼吸道、消化道、肌肉注射等。目前有許多特定的檢測方法來檢測這種有毒植物蛋白，但很少基于毒素活性的檢測。因此探究得到一種可以實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的檢測at活性的方法具有重要意義，這對于識別生物活性毒素也至關(guān)重要。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種基于lc-ms/ms的相思子毒素活性的檢測方法，通過檢測反應(yīng)脫落腺嘌呤峰面積來進(jìn)行樣本定性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過lc-ms/ms建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定相思子毒素的濃度，來達(dá)到檢測相思子毒素的目的，該檢測方案反應(yīng)組分簡單，反應(yīng)時間相對較短，在復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析中更具優(yōu)勢，檢測效果更好，靈敏度更高、特異性更強(qiáng)。
2、為了實現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供以下技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)提供了一種基于lc-ms/ms的相思子毒素活性的檢測方法，其特征在于，包括
4、(1)將系列梯度稀釋的相思子毒素標(biāo)準(zhǔn)品分別與反應(yīng)體系a混合進(jìn)行反應(yīng)，利用lc-ms/ms進(jìn)行檢測，然后以相思子毒素的濃度為橫坐標(biāo)，(陽性樣本脫落的腺嘌呤峰面積與內(nèi)標(biāo)阿昔洛韋相應(yīng)的峰面積比值):(陰性樣本脫落的腺嘌呤峰面積與內(nèi)標(biāo)阿昔洛韋相應(yīng)的峰面積比值)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；
5、(2)將待測樣本與反應(yīng)體系a混合進(jìn)行反應(yīng)，利用lc-ms/ms進(jìn)行檢測，根據(jù)脫落腺嘌呤峰面積對樣本定性，若待測樣本為陽性樣本，并將(陽性樣本脫落的腺嘌呤峰面積與內(nèi)標(biāo)阿昔洛韋相應(yīng)的峰面積比值):(陰性樣本脫落的腺嘌呤峰面積與內(nèi)標(biāo)阿昔洛韋相應(yīng)的峰面積比值)代入步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到相思子毒素的濃度；當(dāng)待測樣本的脫落腺嘌呤峰面積與陰性對照組脫落腺嘌呤峰面積的比值大于5，則表明為陽性樣本。
6、作為優(yōu)選，所述反應(yīng)體系a包括檸檬酸銨+mg2++edta緩沖液、bsa溶液、寡核苷酸鏈底物以及內(nèi)標(biāo)阿昔洛韋溶液。
7、作為優(yōu)選，所述lc-ms/ms的液相色譜條件為：色譜柱為waters?-c18反相柱，內(nèi)徑×長度為2.1mm×150mm，粒徑為3.5μm；流動相為10mm甲酸銨，ph＝4；有機(jī)相為100％甲醇；流速為0.2ml/min；進(jìn)樣量為2μl。
8、作為優(yōu)選，所述lc-ms/ms的mrm模式參數(shù)為：腺嘌呤m/z?136→m/z?92，m/z?136→m/z?119；阿昔洛韋m/z?226.1→m/z?134.9，m/z?226.1→m/z?152.05。
9、作為優(yōu)選，步驟(2)所述反應(yīng)的時間為1.5-2.2h，所述反應(yīng)的溫度為42-46℃。
10、作為優(yōu)選，步驟(2)所述檸檬酸銨+mg2++edta緩沖液的ph為4.0-4.1，檸檬酸銨+mg2++edta緩沖液中檸檬酸銨的終濃度為0.1-10mm，檸檬酸銨+mg2++edta緩沖液中mg2+的終濃度為0.1-5mm，檸檬酸銨+mg2++edta緩沖液中edta的終濃度為0.1-10mm；
11、所述bsa溶液的終濃度為8-12μg/ml；
12、所述寡核苷酸鏈底物的終濃度為0.1-0.3μm；
13、所述內(nèi)標(biāo)阿昔洛韋溶液的終濃度為8-12ng/ml。
14、作為優(yōu)選，步驟(2)所述寡核苷酸鏈底物的序列如seq?id?no.11所示。
15、作為優(yōu)選，步驟(2)所述陰性對照組測定的是無菌水。
16、通過采用上述技術(shù)方案，本專利技術(shù)具有如下有益效果：
17、本專利技術(shù)技術(shù)方案利用相思子毒素的n-糖苷酶活性能特異性的切割核糖體上的腺嘌呤而建立的檢測方法，反應(yīng)原理是at發(fā)揮n-糖苷酶活性，使底物脫落腺嘌呤，通過檢測反應(yīng)脫落腺嘌呤峰面積來進(jìn)行樣本定性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過lc-ms/ms建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定相思子毒素的濃度，達(dá)到檢測毒素的目的。該檢測方案反應(yīng)組分簡單，反應(yīng)時間相對較短，在復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析中更具優(yōu)勢，檢測效果更好，靈敏度更高、特異性更強(qiáng)。
18、本專利技術(shù)中實驗也表明了最優(yōu)反應(yīng)體系為ph為4.05的檸檬酸銨+mg2++edta緩沖液、終濃度為10μg/ml的bsa溶液、終濃度為0.2μm的直鏈單鏈dna20a底物、終濃度為10ng/ml的內(nèi)標(biāo)阿昔洛韋溶液；最佳反應(yīng)溫度為45℃，最佳反應(yīng)時間為2h。采用本專利技術(shù)檢測方法結(jié)合上述最優(yōu)反應(yīng)參數(shù)，測得使用包被抗體的磁珠進(jìn)行富集后的相思子毒素樣本，檢測靈敏度可達(dá)到0.391ng/ml。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種基于LC-MS/MS的相思子毒素活性的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述LC-MS/MS的液相色譜條件為：色譜柱為Waters-C18反相柱，內(nèi)徑×長度為2.1mm×150mm，粒徑為3.5μm；流動相為10mM甲酸銨，pH＝4；有機(jī)相為100％甲醇；流速為0.2mL/min；進(jìn)樣量為2μL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述LC-MS/MS的MRM模式參數(shù)為：腺嘌呤m/z?136→m/z?92，m/z?136→m/z?119；阿昔洛韋m/z?226.1→m/z?134.9，m/z226.1→m/z152.05。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述反應(yīng)的時間為1.5-2.2h，所述反應(yīng)的溫度為42-46℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述檸檬酸銨+Mg2++EDTA緩沖液的pH為4.0-4.1，檸檬酸銨+Mg2++EDTA緩沖液中檸檬酸銨的終濃度為0.1-10mM，檸檬酸銨+Mg2++EDTA緩沖液
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述寡核苷酸鏈底物的序列如SEQ?ID?NO.11所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述陰性對照組測定的是無菌水。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于lc-ms/ms的相思子毒素活性的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述lc-ms/ms的液相色譜條件為：色譜柱為waters-c18反相柱，內(nèi)徑×長度為2.1mm×150mm，粒徑為3.5μm；流動相為10mm甲酸銨，ph＝4；有機(jī)相為100％甲醇；流速為0.2ml/min；進(jìn)樣量為2μl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述lc-ms/ms的mrm模式參數(shù)為：腺嘌呤m/z?136→m/z?92，m/z?136→m/z?119；阿昔洛韋m/z?226.1→m/z?134.9，m/z226.1→m/z152.05。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：辛文文，李佳欣，康琳，董理娜，柳婷婷，高姍，王菁，王景林，
申請(專利權(quán))人：中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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