【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物防治，具體來說涉及一種用于檢測煙草葉部病原喀斯特炭疽菌的rpa-lfd引物組合物，同時涉及該用于檢測煙草喀斯特炭疽菌的rpa-lfd引物組合物在檢測煙草喀斯特炭疽菌方面的應用。
技術介紹
1、煙草炭疽病是煙草葉部發生的主要真菌病害之一，在中國煙草產區均有發生，但在西南煙區發生普遍。其中，喀斯特炭疽菌是煙草炭疽病的重要病原菌。在煙草生長的中后期，赤星病、炭疽病、靶斑病等多種葉斑病混合發生，較為復雜，且這些病害的癥狀相似且難以區分。傳統的病害識別需要通過病害癥狀、病原菌的生物學形態等特點，進行病害識別，易受到人為因素的影響，鑒定耗時長，精準度低。隨著技術的發展，聚合酶鏈反應(?pcr?)、q-pcr等分子生物學檢測技術已被成功應用于植物病原菌的檢測。如與傳統病害識別方法相比，這些檢測方法具有高精準度，但大多需要專業技術人員和設備，檢測速度較慢，嚴重限制了煙草葉斑類病害的快速識別診斷。因此，開發快速簡便的煙草炭疽病病原菌檢測技術對煙草的生產具有重要意義。
2、重組酶聚合酶擴增法(?rpa?)是一種新型核酸等溫擴增方法，與傳統pcr擴增法、q-pcr和lamp檢測相比，其顯著的優勢是溫和的反應溫度范圍和更短的反應時間。通過與熒光基團標記的反應，rpa技術與側流層析試紙條(?lfd?)相結合，實現擴增產物的可視化檢測，不需復雜儀器設備，適合現場快速檢測，可以實現病原物高特異性、高靈敏度的可視化快速檢測，具有極為廣泛的應用前景。rpa檢測的關鍵在于特異性引物的設計，目前對于喀斯特炭疽菌的rpa檢測方法尚未見報道
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于克服上述缺點而提供的一種檢測周期短、特異性強，靈敏度高，適合現場可視化快速檢測的用于檢測煙草喀斯特炭疽菌的rpa-lfd引物組合物。
2、本專利技術的另一目的還在于提供該用于檢測煙草喀斯特炭疽菌的rpa-lfd引物組合物在檢測煙草喀斯特炭疽菌方面的應用。
3、本專利技術的一種用于快速檢測喀斯特炭疽菌（ colletotrichum?karstii）的rpa-lfd引物組合物，包括用于檢測的引物對和探針，所述引物對：
4、上游引物：5’-gaagattgtcgtctgcgtagtcagcgacggtcg-3’；下游引物：5’-?biotin-gttcttttccttcaagcagaacagcatctgaacgg-3’；
5、探針：
6、5’-6-fam-?gcagcgggcttcgtggctttcgcctgctgctgc/idsp/gcttggggcgcatat?-spacer?c3?-?3’；
7、所述下游引物5’端使用生物素（biotin）標記，所述探針5’端的熒光基團為6-羚基熒光素（fam?），3’端的熒光基團為亞磷酰胺（c3?spacer）。
8、本專利技術的一種用于檢測煙草喀斯特炭疽菌的rpa-lfd引物組合物在檢測植物喀斯特炭疽菌的應用。
9、本專利技術的一種快速檢測植物喀斯特炭疽菌的rpa-lfd引物組合物在檢測植物喀斯特炭疽菌的rpa-lfd試劑盒方面的應用。
10、上述的一種含有快速檢測植物喀斯特炭疽菌的rpa-lfd引物組合物的試劑盒，包括重組酶聚合酶擴增引物混合液和lfd引物混合液，50?μl檢測反應體系中含有a?緩沖液29.4?μl、10?μm的正向引物2?μl，10?μm的反向引物2?μl，10?μm的探針0.6?μl，b?緩沖液5?μl，dna模板2?μl，無菌水補足至50?μl。
11、上述的一種快速檢測植物喀斯特炭疽菌的rpa-lfd試劑盒快速檢測植物病菌的方法，包括以下步驟：
12、（1）提取樣本核酸；
13、（2）采用組合物對步驟（1）提取的樣本核酸進行rpa擴增反應，50?μl檢測反應體系中含有a?緩沖液?29.4?μl、10?μm的正向引物2?μl，10?μm的反向引物2?μl，10?μm的探針0.6μl，b?緩沖液5?μl，10?ng/μl待測dna模板2?μl，無菌水補足至50?μl；rpa-lfd擴增反應程序為：39℃，8?min；
14、（3）取10?μl步驟（2）得到的反應產物加入至190?μl?ddh2o中，混勻后取50?μl稀釋后的擴增產物滴入膠體金試紙條加樣孔，5?min內記錄控制線和檢測線，判定試驗結果，若控制線可見，檢測線不可見，此為陰性結果（即判定dna模板對應的待測物中不含有植物病原喀斯特炭疽）；若檢測線和控制線均可見，此為陽性結果（即判定dna模板對應的待測物中含有植物病原喀斯特炭疽）；若檢測線和控制線均不可見，需要重新進行檢測。
15、本專利技術與現有技術相比，具有明顯的有益效果，從以上技術方案可知：本專利技術通過對煙區的煙草炭疽菌病的病菌進行分離、鑒定，對群體進行多樣性分析，研發出可實現喀斯特炭疽菌高特異性、高靈敏度的可視化快速檢測的用于檢測煙草喀斯特炭疽菌的rpa-lfd引物組合物，能特異性地檢測出煙草炭疽病菌，而對其它煙草葉部病菌沒有反應。本專利技術的檢測過程僅需要8分鐘，能快速識別病原菌。采用恒溫擴增，反應條件溫和，特異性和靈敏度高，最低檢測濃度為1?pg/μl。
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1.一種用于快速檢測喀斯特炭疽菌（Colletotrichum?karstii）的RPA-LFD引物組合物，包括用于檢測的引物對和探針，所述引物對：
2.一種用于檢測煙草喀斯特炭疽菌的RPA-LFD引物組合物在檢測植物喀斯特炭疽菌的應用。
3.如權利要求2所述的一種快速檢測植物喀斯特炭疽菌的RPA-LFD引物組合物在檢測植物喀斯特炭疽菌的RPA-LFD試劑盒方面的應用。
4.如權利要求2或3所述的一種含有快速檢測植物喀斯特炭疽菌的RPA-LFD引物組合物的試劑盒，包括重組酶聚合酶擴增引物混合液和LFD引物混合液，50?μL檢測反應體系中含有A?緩沖液?29.4?μL、10?μM的正向引物2?μL，10?μM的反向引物2?μL，10?μM的探針0.6?μL，B?緩沖液5?μL，DNA模板2?μL，無菌水補足至50?μL。
5.如權利要求4所述的一種快速檢測植物喀斯特炭疽菌的RPA-LFD試劑盒快速檢測植物病菌的方法，包括以下步驟：
【技術特征摘要】
1.一種用于快速檢測喀斯特炭疽菌（colletotrichum?karstii）的rpa-lfd引物組合物，包括用于檢測的引物對和探針，所述引物對：
2.一種用于檢測煙草喀斯特炭疽菌的rpa-lfd引物組合物在檢測植物喀斯特炭疽菌的應用。
3.如權利要求2所述的一種快速檢測植物喀斯特炭疽菌的rpa-lfd引物組合物在檢測植物喀斯特炭疽菌的rpa-lfd試劑盒方面的應用。
4.如權利要求2或3所述的一種含有...
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡劉體，汪漢成，張傳清，許靈杰，涂永高，陸寧，孟建玉，唐軍，
申請(專利權)人：貴州省煙草科學研究院，
類型：發明
國別省市：
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