【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及黃嘌呤氧化酶制備，特別涉及一種固定化黃嘌呤氧化酶制備方法。本專利技術還涉及一種用于該固定化黃嘌呤氧化酶制備方法的制備系統。
技術介紹
1、黃嘌呤氧化酶是一種含鉬和非血紅素鐵的黃素酶，能夠氧化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸，直接調控著體內尿酸水平的高低，是體內嘌呤代謝的關鍵酶。黃嘌呤氧化酶作為一種重要的代謝調控酶，但游離酶較差的穩定性影響其應用。國外技術中大多集中在改變溶液環境提高酶熱穩定性的方向研究，我國有采用修飾的瓊脂糖介質及大孔陰離子交換樹脂固定化黃嘌呤氧化酶，發現以谷氨酸為連接臂的瓊脂糖介質(sepharose-glu)固定化效果最佳，酶活回收率達到15.5％。其原因在于谷氨酸含有兩個游離羧基，瓊脂糖-谷氨酸介質可多點交聯黃嘌呤氧化酶，使固定化酶更加牢固，穩定性增加，但這同時也可能引起底物進入酶催化中心受阻，使得固定化酶表觀酶活力下降。
2、殼聚糖是一種天然可降解的堿性多糖，價廉易得，無毒無害，生物相容性好，在水處理，固定化酶，多酚吸附，重金屬吸附，藥物載體等方面都有廣泛的應用。殼聚糖富含氨基，可以用來吸附有機酸，但是在殼聚糖在酸性溶液中易流失，具有較弱的機械穩定性，且與溶液分離困難，難以直接利用。
3、現有技術中，有的研究方向是通過制備磁性顆粒，并以此為磁核制備磁性殼聚糖微球，以環氧氯丙烷對微球進行活化用于對黃嘌呤氧化酶固定化，但在制備過程中，環氧氯丙烷屬于有害物質，蒸氣對呼吸道有強烈刺激性。反復和長時間吸入能引起肺、肝和腎損害。高濃度吸入致中樞神經系統抑制可致死。其蒸氣對眼有強烈刺激性，
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術旨在提出一種固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，使用新的不具有毒性的位置替代環氧氯丙烷對微球的活化，并保證黃嘌呤氧化酶良好的熱穩定性及操作穩定性。
2、為達到上述目的，本專利技術的技術方案是這樣實現的：
3、一種固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，包括如下步驟，
4、s1，取多種原料進行混合，通過超聲進行溶解后倒入反應體系中進行反應，獲得磁性fe3o4微粒；
5、s2，制備殼聚糖醋酸溶液，并加入β環糊精，合成得到chitosan-β-cd化合物；
6、s3，將s1中的fe3o4微粒加入s2中的溶液中，并同時加入具有zn離子的無機化合物，超聲分散30min溶解并攪拌反應，進行洗滌后干燥至恒重獲得新的殼聚糖微球新載體；
7、s4，分散后加入液體石蠟、吐溫，山梨醇脂肪酸酯，在水浴條件下攪拌30min；
8、s5，逐滴加入戊二醛溶液，升溫至60℃，攪拌1h，逐滴加入冰醋酸和氨水調節溶液調節ph值，恒溫水浴振蕩后進超聲處理，冷卻后磁鐵吸附分離，真空烘烤后恒重獲得包覆新載體的fe3o4磁性殼聚糖微球；
9、s6，取一定量的s5中的磁性fe3o4微粒于離心管中，加入一定量的黃嘌呤氧化酶酶液，并放入一定量的tris-hcl緩沖液，在一定溫度下水浴振蕩一段時間，獲得固定化黃嘌呤氧化酶；
10、s7，研究固定化黃嘌呤氧化酶性能分析，確定固定化工藝條件。
11、進一步的，s1包括如下步驟：
12、s11，稱取0.73mol/l的fecl3·6h2o和0.32mol/l的fecl2·4h2o于燒杯中，并用蒸餾水進行超聲溶解，采用引導棒引流至攪拌容器中，并繼續采用蒸餾水反復潤洗后倒入反應體系中；
13、s12，在所述反應體系中通入氮氣，并進行持續攪拌，加入一定濃度的naoh，邊滴加邊攪拌，并使反應體系保持恒定溫度；
14、s13，反應結束后加入油酸，高溫水浴振蕩下熟化，并進行超聲處理；
15、s14，冷卻后磁鐵吸附，用無水乙醇和去離子進行多次水洗滌，洗至上清液的ph為中性，進行干燥處理，獲得磁性fe3o4微粒。
16、進一步的，步驟s1中還包括s15，對獲得的磁性fe3o4微粒進行活化處理，并在活化處理后進行環氧基密度測定；
17、環氧基密度計算公式為：
18、s＝cv/m
19、式中，s為環氧基密度，mmol/g，v為消耗標準鹽酸體積，c為標準鹽酸濃度，mmol/l，m為活化的磁性殼聚糖微球的質量，g。
20、進一步的，步驟s15包括：
21、s151，稱取適量磁性fe3o4微粒于離心管內，加入一定濃度的naoh溶液，一定體積分數的環氧氯丙烷溶液，攪拌均勻；
22、s152，加入一定量的nabh4，進行恒溫水浴振蕩反應4h；
23、s153，以環氧基密度為活化指標，研究環氧氯丙烷體積分數，nabh4濃度及naoh濃度對活化工藝的影響；
24、s154，活化結束后，用無水乙醇不斷洗滌微球。
25、進一步的，步驟s6中還包括固定化黃嘌呤氧化酶酶活的測定，稱取一定量的磁性微球固定化黃嘌呤氧化酶于離心管中，加入一定濃度的黃嘌呤標準液，顯色液，水浴保溫后磁鐵分離，取清液測定吸光值；
26、固定化黃嘌呤氧化酶活力u/g的的計算公式為：
27、u/g＝cv/mt
28、式中，c為h2o2濃度，mmol/l；v為溶液總體積，t為反應時間，min；m為微球質量，g。
29、進一步的，所述金屬離子為zn2+離子，所述無機化合物為zncl2·6h2o。
30、進一步的，所述無機化合物zncl2·6h2o與所述磁性fe3o4微粒的比例為2.4～3倍。
31、進一步的，所述固定化工藝條件為：所述黃嘌呤氧化酶酶液濃度為2.5-3vol％，固定化時間t為20-30h，固定化溫度為30-40℃，ph為6.0-8.0。
32、相對于現有技術，本專利技術具有以下優勢：
33、本專利技術所述的固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，通過化學共沉淀法和乳化交聯法制備得到磁性fe3o4微粒，將微粒加入殼聚糖醋酸溶液中，并加入β環糊精，殼聚糖與β環糊精反應，形成殼聚糖-β-cd共價連接的產物chitosan-β-cd，同時加入金屬離子，金屬離子與從而形成黃嘌呤氧化酶。并在殼聚糖微球制備過程中金屬離子的摻雜，得到具有金屬離子的殼聚糖微球新載體，再接枝戊二醛，利用新載體中的醛基與黃嘌呤中的氨基發生席夫堿反應，實現黃嘌呤氧化酶的固定化。如此設置，不僅能夠增加殼聚糖微球新載體的穩定性，還能增加固定化黃嘌呤氧化酶的可重復實用性和操作穩定性。
34、本專利技術的另一目的在于提出一種固定化黃嘌呤氧化酶制備系統，該制備系統采用如上所述的固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，
35、所述制備系統包括混料攪拌單元，水浴加熱單元，產品收集單元，以及離心單元；
36、所述混料攪拌單元包括混合箱，樞轉連接在所述混合箱內的超聲溶解單元，以及攪拌所述超聲溶解單元的溶解溶液的攪拌單元，所述攪拌單元與外部氮氣罐連接，
【技術保護點】
1.一種固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，其特征在于：
2.根據權利要求1所述的固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，其特征在于：
3.根據權利要求2所述的固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，其特征在于：
4.根據權利要求3所述的固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，其特征在于：
5.根據權利要求3所述的固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，其特征在于：
6.根據權利要求1所述的固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，其特征在于：
7.根據權利要求3所述的固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，其特征在于：
8.根據權利要求1所述的固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，其特征在于：
9.一種固定化黃嘌呤氧化酶制備系統，其特征在于：
10.根據權利要求9所述的一種固定化黃嘌呤氧化酶制備系統，其特征在于：
【技術特征摘要】
1.一種固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，其特征在于：
2.根據權利要求1所述的固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，其特征在于：
3.根據權利要求2所述的固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，其特征在于：
4.根據權利要求3所述的固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，其特征在于：
5.根據權利要求3所述的固定化黃嘌呤氧化酶制備方法，其特征在于：
<...【專利技術屬性】
技術研發人員：蘇少博，李亞男，黃茹龍，
申請(專利權)人：深圳瑞亞力集團有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。