聚乙二醇修飾的人血白蛋白及其制備方法技術

本發明專利技術涉及生物醫藥技術領域，特別是聚乙二醇修飾的人血白蛋白及其制備方法。所述聚乙二醇修飾的人血白蛋白，由白蛋白分子上的３４位半胱氨酸殘基的巰基、Ｎ－末端氨基或自由氨基結合聚乙二醇構成。其中定點單修飾所采用的修飾劑分別是聚乙二醇－馬來酰亞胺和聚乙二醇－丙醛，自由氨基隨機修飾所采用的修飾劑聚乙二醇－琥珀酰亞胺活性酯或氰尿酰氯活化的單甲氧基聚乙二醇，結合聚乙二醇的白蛋白分子上的自由氨基的修飾率是３％－７８％。本發明專利技術制得的聚乙二醇修飾的人血白蛋白與天然白蛋白相比，具有半衰期延長，血漿清除減慢等優良特性，有利于減少用藥頻率，緩解白蛋白來源緊張問題。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物醫藥
，特別是。
技術介紹
人血白蛋白(human serum albumin,HSA)是一種含585個氨基酸殘基的單鏈無糖 基化蛋白質，是人血漿中最豐富的蛋白質，約占血漿總蛋白的60%。 人血白蛋白是臨床上常用的一種天然血液制品，由健康人的血漿中分離提取制 成，屬于血容量擴充藥物，主要用于治療失血、燒傷及創傷等引起的休克，腦水腫、大腦損傷 所致的顱內壓升高，以及低蛋白血癥及肝硬化或腎病引起的水腫和腹水。人血白蛋白適應 癥廣泛，且用量大(每個病人每天人血白蛋白用量達幾克)，擁有巨大的市場需求量。 近年來，由于血液來源緊張等原因致使人血白蛋白供應十分緊張，如何解決當前 白蛋白緊缺的問題成為目前白蛋白研究的熱點。基于此，科研工作者主要圍繞以下兩個 方面展開研究，尋找人血白蛋白的替代品一是利用聚乙二醇(PEG)對非人源白蛋白進行 修飾以消除其免疫原性，但其安全性讓人擔憂；二是利用基因重組技術生產人血清白蛋白 (rHSA)，目前，利用細菌、真菌、植物及動物高效表達人血白蛋白已成功，但是實現藥用級 rHSA的大規模生產是個極具挑戰性的課題。因為99. 999%的純度對于臨床上一般的重組 蛋白藥物來說已經足夠，而白蛋白的常規劑量通常為10g，該純度的白蛋白中雜質絕對量 (lmg)遠遠無法達到臨床應用的要求。更高純度rHSA的純化步驟繁多，成本高，收率低，因 此，目前rHSA工業化生產的例子很少，血漿來源人血白蛋白仍是臨床用人血白蛋白的最主 要來源。 如果能夠通過一定的手段增加人血白蛋白的分子量，將會大大增加人血白蛋白的 血管保留率，延長其體內半衰期，降低用藥頻率，進而有效緩解人血白蛋白來源緊缺的問 題。經檢索，利用PEG及其衍生物修飾人血白蛋白制備人血白蛋白結合物，以延長給藥周 期，實現白蛋白長效給藥的相關研究和應用還未見報道。
技術實現思路
針對現有技術的不足，本專利技術提供了聚乙二醇(簡稱PEG，下同)修飾的人血白 蛋白及其制備方法的技術方案，其目的在于克服上述人血白蛋白在臨床應用中所存在的缺 點。 本專利技術所述的聚乙二醇修飾的人血白蛋白，分別由白蛋白分子上的34位半胱氨 酸殘基的巰基J-末端氨基或自由氨基結合聚乙二醇構成，所述34位半胱氨酸巰基定點單 修飾所采用的修飾劑是聚乙二醇-馬來酰亞胺(mPEG-MAL);所述N-末端氨基定點單修飾 所采用的修飾劑為單甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD);所述自由氨基隨機修飾所采用的 修飾劑為單甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺活性酯或氰尿酰氯活化的單甲氧基聚乙二醇，結 合聚乙二醇的白蛋白分子上的自由氨基的修飾率是3% -78% ;隨著修飾反應的進行，其自由氨基的修飾率逐漸增大。 上述的白蛋白的34位半胱氨酸的聚乙二醇定點單修飾產物中所述修飾劑 mPEG-MAL的分子量范圍為500-80000道爾頓。 其中所述修飾劑mPEG-MAL的優選分子量范圍為1000-40000道爾頓。 其中所述修飾劑mPEG-MAL的形狀為直鏈或分枝狀。 其中所述修飾劑mPEG-MAL的形狀優選為分枝狀。 上述的白蛋白的N-末端氨基的聚乙二醇定點單修飾產物中所述修飾劑 mPEG-ALD的分子量范圍為1000-80000道爾頓。其中所述修飾劑mPEG-ALD的優選分子量范圍為1000-40000道爾頓。 其中所述修飾劑mPEG-ALD的形狀為直鏈或分枝狀。 其中所述修飾劑mPEG-ALD的形狀優選為分枝狀。 上述的白蛋白的自由氨基的聚乙二醇隨機修飾產物中所述自由氨基隨機修飾所 采用的修飾劑為mPEG-SPA、 mPEG-SC、 mPEG-SBA、 mPEG-NHS、 mPEG2_NHS和氰尿酰氯活化的 mPEG其中的一種。 其中所述自由氨基隨機修飾所采用的修飾劑優選為mPEG-SPA、 mPEG-SBA和 mPEG2-NHS。 其中所述自由氨基隨機修飾所采用的修飾劑的分子量范圍為500-40000道爾頓。 其中所述自由氨基隨機修飾所采用的修飾劑的優選分子量范圍為1000-20000 道爾頓。其中所述自由氨基隨機修飾所采用的修飾劑的形狀為直鏈或分枝狀。其中所述白蛋白的自由氨基的mPEG隨機修飾產物為2-45個mPEG鏈連接在一個白蛋白分子上。 本專利技術所述PEG修飾的人血白蛋白制備方法，由以下步驟組成 (1)將mPEG-MAL與白蛋白按摩爾比為2-20 : 1的比例溶于10-lOOmmol/L磷酸鹽 緩沖液(含1Ommol/L EDTA)中，在p朋.0-7. 0，溫度20-37。C條件下，輕輕振蕩10_30h，即得 白蛋白34位半胱氨酸的mPEG定點單修飾產物。 或者，將mPEG-ALD與純白蛋白按摩爾比為2-10 : 1的比例溶于20-80mmol/L醋酸 鹽緩沖液中，以5-50mmol/L硼氫化鈉為還原劑，在pH5. 0_5. 5、溫度15-37。C條件下，振蕩反 應5-30h，將反應液pH調為4，稀鹽酸稀釋5倍，終止反應，即得白蛋白的N-末端氨基mPEG 定點單修飾產物。 或者，將mPEG-琥珀酰亞胺活性酯(如mPEG-SPA)與白蛋白按摩爾比2_40 : 1 的比例溶于P朋.5-9. 5、10-50mmol/L的磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液中，4-30。C輕輕振蕩反應 0. 5-24h，即得白蛋白自由氨基的mPEG隨機修飾產物。 或者，將氰尿酰氯活化的mPEG與人血白蛋白按摩爾比2-40 : l的比例溶于pH 8-10、10mmol/L四硼酸鈉緩沖液中，溫度4-3(TC條件下，振搖反應0. 5-24h后，加甘氨酸終 止修飾反應，即得白蛋白自由氨基的mPEG隨機修飾產物。 其中，上述白蛋白以白蛋白的蛋白含量進行摩爾計算。 (2)采用離子交換層析法分別對mPEG修飾的人血白蛋白進行分離純化，pH5. 0-7. 0、10-50mmol/L磷酸鹽緩沖液平衡、上樣，0-lmol/L NaCl線性梯度洗脫，收集洗脫 峰，冷凍干燥，制得純品。 上述的白蛋白的34位半胱氨酸的聚乙二醇定點單修飾產物制備方法中所述修 飾劑mPEG-MAL與白蛋白的摩爾比優選為2 : 1 ;磷酸鹽緩沖液的濃度為50mmol/L，pH值為 6. 5 ;反應溫度為30°C ;反應時間為20h。 上述白蛋白的N-末端氨基的mPEG定點單修飾產物制備方法中所述修飾劑 mPEG-ALD與白蛋白的摩爾比優選為5 : 1 ;所述醋酸鹽緩沖液的濃度優選為50mmol/L ;硼 氫化鈉的濃度優選為20mmol/L ;所述醋酸鹽緩沖液的pH優選為5. 0 ;反應溫度為30°C ;反 應時間為24h。 上述白蛋白的自由氨基的mPEG隨機修飾產物制備方法中所述mPEG-琥珀酰亞胺 活性酯(如mPEG-SPA)與白蛋白摩爾比優選為5-20 : 1，反應緩沖液優選為pH8. 0、50mmo1/ L的磷酸鹽緩沖液；反應溫度為20°C ;反應時間優選為10h。 上述白蛋白的自由氨基的mPEG隨機修飾產物制備方法中，所述氰尿酰氯活化的 mPEG與白蛋白的摩爾比優選為10 : 1 ;四硼酸鈉緩沖液的pH值優選為9.0 ;反應溫度為 20°C ;反應時間優選為10h。 上述的聚乙二醇修飾的人血白蛋白制備方法中所述離子交換層析法優選采用DE本文檔來自技高網...

【技術保護點】
聚乙二醇修飾的人血白蛋白，由白蛋白分子上的３４位半胱氨酸殘基的巰基、Ｎ－末端氨基或自由氨基結合聚乙二醇構成，其特征是：所述３４位半胱氨酸巰基定點單修飾所采用的修飾劑是聚乙二醇－馬來酰亞胺（ｍＰＥＧ－ＭＡＬ）；所述Ｎ－末端氨基定點單修飾所采用的修飾劑為聚乙二醇－丙醛（ｍＰＥＧ－ＡＬＤ）；所述自由氨基隨機修飾所采用的修飾劑為聚乙二醇－琥珀酰亞胺活性酯或氰尿酰氯活化的單甲氧基聚乙二醇，結合聚乙二醇的白蛋白分子上的自由氨基的修飾率是３％－７８％。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王鳳山，龐廣禮，趙婷，譚海寧，仲立軍，劉純慧，馬山，劉欣晏，
申請(專利權)人：山東泰邦生物制品有限公司，山東大學藥學院，
類型：發明
國別省市：37[中國|山東]