【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及腫瘤動(dòng)物模型，具體涉及一種骨肉瘤pdx模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、病人來(lái)源的腫瘤組織（patient?derived?tumor），來(lái)源于患者，腫瘤組織組成多樣，異質(zhì)性完整，具有重要的科研和臨床應(yīng)用價(jià)值。隨著免疫缺陷小鼠的發(fā)展，將病人來(lái)源的腫瘤組織接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)成為可能，為腫瘤藥物的開發(fā)，免疫治療的發(fā)展以及各種靶向藥物的測(cè)試提供了非常好的模型。pdx模型（patient-derived?xenograft?model，pdx）是一種通過(guò)將手術(shù)切除的病人腫瘤組織接種于免疫缺陷鼠體內(nèi)而建立的新一代人源腫瘤異種移植模型。這種模型保留了原代腫瘤的組織學(xué)、遺傳學(xué)特征并維持了病人腫瘤的異質(zhì)性，其藥效學(xué)結(jié)果與臨床具有極高的相關(guān)性。
2、已有的骨肉瘤pdx模型的構(gòu)建方法：將患者腫瘤標(biāo)本使用rpmi?1640培養(yǎng)基（康寧公司，美國(guó)紐約）清洗后，切成3~5?mm3的小塊，然后用25g穿刺套管針吸入，該套管針用于鈍性分離結(jié)締組織，隨后通過(guò)推動(dòng)組織套管針，在免疫缺陷小鼠下肢的腹股溝進(jìn)行皮下組織接種（s.c.）；每周測(cè)量一次皮下腫瘤的體積，在達(dá)到500?mm3時(shí)切除腫瘤以進(jìn)行傳代和冷凍保存。傳代方法與骨肉瘤pdx模型構(gòu)建方法一致，分為組織清洗——切成3~5mm3小塊——利用穿刺套管針于腹股溝皮下接種。冷凍保存方法為：首先，將腫瘤樣本切成3?mm3的小塊，浸泡在適當(dāng)?shù)谋４嬉褐校摫４嬉旱?0%為rpmi?1640培養(yǎng)基，30%為胎牛血清（杭州斯基慶生物工程材料有限公司，中國(guó)杭州），10%為二甲基亞砜（amere
3、現(xiàn)有的骨肉瘤pdx模型構(gòu)建方法存在的不足包括：使用套管穿刺針時(shí)需要多人配合，并且需要掌握皮下穿刺的技術(shù)；對(duì)腫瘤樣本體積大小和接種數(shù)量限制較為嚴(yán)格，因?yàn)榻M織套管穿刺針直徑限制，導(dǎo)致過(guò)大的腫瘤組織不方便操作；腫瘤冷凍采用傳統(tǒng)的程序化冷凍保存，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)提供一種骨肉瘤pdx模型的構(gòu)建方法，包括：s1、骨肉瘤患者腫瘤樣本預(yù)處理，s2、小鼠皮下接種。s1具體地包括：s11、先經(jīng)過(guò)生理鹽水對(duì)腫瘤樣本進(jìn)行清洗，然后將腫瘤樣本放置于0~4℃的低溫培養(yǎng)液中存儲(chǔ)轉(zhuǎn)運(yùn)，再通過(guò)常溫的pbs溶液對(duì)腫瘤樣本進(jìn)行清洗，其中，所述培養(yǎng)液包括85%以上的pbs溶液和10%的胎牛血清；s12、采用機(jī)械法將腫瘤樣本切成2~3mm3的組織塊。s2具體地包括：s21、基于患者的腫瘤樣本所形成的組織塊的數(shù)量，對(duì)每個(gè)患者準(zhǔn)備至少2只免疫缺陷小鼠進(jìn)行pdx模型構(gòu)建；s22、從每只小鼠的下肢兩側(cè)和/或上肢兩側(cè)選擇接種位點(diǎn)。
2、優(yōu)選地，所述0~4℃的低溫培養(yǎng)液中含有青霉素100-500?u/ml和鏈霉素100-500ug/ml。
3、優(yōu)選地，將腫瘤樣本放置于0~4℃的低溫培養(yǎng)液中存儲(chǔ)轉(zhuǎn)運(yùn)的總時(shí)長(zhǎng)不超過(guò)30分鐘。
4、優(yōu)選地，組織塊的形狀為方形薄片狀。
5、優(yōu)選地，免疫缺陷小鼠為6~8周齡t、b、nk細(xì)胞三重極重度的免疫缺陷小鼠。
6、優(yōu)選地，每只小鼠最多選擇4個(gè)接種位點(diǎn)，4個(gè)接種位點(diǎn)分別位于小鼠的下肢兩側(cè)和上肢兩側(cè)。
7、優(yōu)選地，優(yōu)先從小鼠的下肢兩側(cè)選擇接種位點(diǎn)。
8、具體地，當(dāng)接種位點(diǎn)在上肢側(cè)時(shí)，在上腹位置劍突以上0.5㎝利用眼科剪開口，利用鑷子通過(guò)皮下穿行，對(duì)上肢一側(cè)皮下利用鑷子進(jìn)行結(jié)締組織鈍性分離，將分割完成的腫瘤組織利用鑷子夾取后沿著皮下分離的通道送入相應(yīng)的接種位點(diǎn)，將鑷子停留在位點(diǎn)大約10秒鐘時(shí)間，待腫瘤組織不再隨鑷子滑動(dòng)后，對(duì)切口進(jìn)行縫合處理。當(dāng)接種位點(diǎn)在下肢側(cè)時(shí)，在腹中線距離劍突以下1㎝左右剪開0.5㎝開口，利用鑷子鈍性分離皮下組織，并用鈍頭將樣本組織塊遞送至小鼠下肢腹股溝位置，停留大約5秒鐘后，取出鑷子，將切口行單純間斷縫合法進(jìn)行縫合。
9、進(jìn)一步地，還包括：s3、模型傳代。具體地包括：s31、待接種的小鼠體內(nèi)腫瘤體積達(dá)到約1000?mm3后，摘取小鼠的腫瘤組織，得到p0原代；s32、將p0原代進(jìn)行分組，其中一組用于傳代，擴(kuò)大模型的規(guī)模。
10、本專利技術(shù)還提供一種通過(guò)前述方法得到的骨肉瘤pdx模型在篩選預(yù)防或治療骨肉瘤藥物中的應(yīng)用。
11、本專利技術(shù)的特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)包括：
12、（1）采用上腹和/或下腹部切口，特別適用于多個(gè)樣本、多個(gè)位點(diǎn)接種的情況。相較于現(xiàn)有的組織套管針，患者腫瘤的預(yù)處理和動(dòng)物接種的方式更簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)單人操作。
13、（2）腫瘤標(biāo)本離體后處理的時(shí)間嚴(yán)格限定在30分鐘內(nèi)，可以極大的提高腫瘤組織接種的成功率。
14、（3）通過(guò)多位點(diǎn)建立的荷瘤模型，可最大程度利用有限的腫瘤樣本和有限的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，快速擴(kuò)種大批量pdx模型，提高建模效率和建模成本。
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1.一種骨肉瘤PDX模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨肉瘤PDX模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述0~4℃的低溫培養(yǎng)液中含有青霉素100-500?U/ml和鏈霉素100-500?ug/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的骨肉瘤PDX模型的構(gòu)建方法，其特征在于，將腫瘤樣本放置于0~4℃的低溫培養(yǎng)液中存儲(chǔ)轉(zhuǎn)運(yùn)的總時(shí)長(zhǎng)不超過(guò)30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨肉瘤PDX模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述組織塊的形狀為方形薄片狀。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的骨肉瘤PDX模型的構(gòu)建方法，所述免疫缺陷小鼠為6~8周齡T、B、NK細(xì)胞三重極重度的免疫缺陷小鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的骨肉瘤PDX模型的構(gòu)建方法，其特征在于，每只小鼠最多選擇4個(gè)接種位點(diǎn)，4個(gè)接種位點(diǎn)分別位于小鼠的下肢兩側(cè)和上肢兩側(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的骨肉瘤PDX模型的構(gòu)建方法，其特征在于，優(yōu)先從小鼠的下肢兩側(cè)選擇接種位點(diǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的骨肉瘤PDX模型的構(gòu)建方法，其特征在于，
9.根據(jù)權(quán)利
10.一種如權(quán)利要求1～9中任意一項(xiàng)所述方法得到的骨肉瘤PDX模型在篩選預(yù)防或治療骨肉瘤藥物中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種骨肉瘤pdx模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨肉瘤pdx模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述0~4℃的低溫培養(yǎng)液中含有青霉素100-500?u/ml和鏈霉素100-500?ug/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的骨肉瘤pdx模型的構(gòu)建方法，其特征在于，將腫瘤樣本放置于0~4℃的低溫培養(yǎng)液中存儲(chǔ)轉(zhuǎn)運(yùn)的總時(shí)長(zhǎng)不超過(guò)30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨肉瘤pdx模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述組織塊的形狀為方形薄片狀。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的骨肉瘤pdx模型的構(gòu)建方法，所述免疫缺陷小鼠為6~8周齡t、b、...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：宋偉杰，王兆松，田建飛，楊吉龍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：天津市腫瘤醫(yī)院天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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