提供一種宏基因組文庫的保存和篩選方法，一是快速有效地保存海量宏基因組克隆的方法，包括用小量的文庫包裝顆感染一定量的感受態細胞，等分成９６份或９６的整倍數，進行文庫擴增培養與保存；二是通過對同一張膜上的文庫ＤＮＡ模板用不同探針進行多次雜交以提高宏基因組文庫篩選效率的方法，包括用一定溫度的堿性溶液去除雜交膜上的探針，同時保留膜上的ＤＮＡ模板用于不同探針的多次膜雜交，從而提高宏基因組文庫的篩選效率。
【技術實現步驟摘要】
所屬領域本專利技術屬于微生物工程領域，涉及一種快速有效地保存并篩選海量宏 基因組克隆的方法，也就是高效保存和篩選宏基因組文庫的方法。
技術介紹
宏基因組是指環境中可培養和未可培養的全部微生物的基因組總和， 宏基因組文庫技術避開了微生物純培養的瓶頸，是研究和利用微生物、尤其是未可培養微 生物資源的有效途徑。將常規的基因組文庫技術用于宏基因組研究中，通過直接提取環境 樣品中所有微生物的DNA并克隆到合適的載體，即可獲得宏基因組文庫。根據插入片段大 小，宏基因組文庫可以被分成兩類一是克隆于質粒載體或λ噬菌體載體中的小片段文庫 (插入片段小于15000堿基對)；另一類是克隆于粘粒及BAC中的大片段文庫(插入片段大 于30000堿基對)。為了最大程度地涵蓋感興趣的所有微生物，宏基因組文庫的容量通常在 一百萬個克隆以上，對于如此海量的宏基因組文庫克隆群體，有必要專利技術一種快速有效的 保存和篩選方法。宏基因組文庫的傳統保存方法包括挑取單個克隆、每8個或更多個單克 隆合并保存，這一方法不僅費時費力，而且需要占用很大的保存空間。此外，基于序列相似 性用探針進行分子雜交常用于宏基因組文庫的篩選，但是，對同一張膜 上的DNA模板用不 同探針進行多次膜雜交以提高宏基因組文庫篩選效率的方法，還未見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服上述已有技術的局限，提供一種高效保存和篩選 宏基因組文庫的方法。為了實現本專利技術的上述目的，本專利技術提供了如下的技術方案，所述宏基因組文庫的保存是用小量的文庫包裝 顆料感染感受態細胞，保溫后將其等分成96份或96的整倍數，振蕩培養，加入甘油保存；所 述宏基因組文庫的篩選是用氫氧化鈉加十二烷基磺酸鈉溶液漂洗雜交膜，去除探針的同時 保留膜上的DNA模板用于不同探針的多次膜雜交。更具體地，本專利技術中，所述宏基因組文庫的保存 是取1 100微升的文庫包裝顆粒與1 10毫升感受態細胞混勻，25 39°C保溫20 60分鐘，將該細胞混合物等分成96份或96的整倍數，每份加0. 2-2毫升LB培養液，所述 LB培養液為胰蛋白胨10克/升+酵母提取物5克/升+氯化鈉5克/升，pH7. 0，在28 39°C振蕩培養12 24小時，加入甘油保存；所述宏基因組文庫的篩選是把已進行過探針 雜交的雜交膜放入預熱的0. 2M氫氧化鈉加以重量/體積即克/100毫升為單位的0. 的 十二烷基磺酸鈉溶液中，在37°C、55°C、68°C漂洗兩次，每次10分鐘、20分鐘、30分鐘，然后 用300mM氯化鈉加30mM檸檬酸鈉溶液徹底漂洗，去除探針的同時保留膜上的DNA模板用于 不同探針的多次膜雜交。上述的中，所述感受態細胞的獲取是挑取前一天 劃線培養的EPI300單克隆至5毫升LB培養基中，37°C下每分鐘200轉培養12小時；按 1 10的比例轉接至15毫升新鮮添加了 IOmM硫酸鎂的LB培養液中，37°C下每分鐘200轉 培養100分鐘使細胞密度達到0D_約0. 9，由此獲得感受態細胞。上述的中，已進行過探針雜交的雜交膜分兩次在 68°C中處理30分鐘能完全去除探針，將去除探針的雜交膜用不同探針再進行多次雜交。本專利技術的方法，由于一是基于用小量的文庫包裝顆感染一定量的感受態細胞，等 分成96份或96的整倍數，進行文庫擴增培養與保存；每個保存孔的平均克隆數在100 800個，視文庫的滴度而定。因此，無需逐個挑取單克隆，快速而有效地保存了宏基因組文 庫。二是基于用一定溫度的堿性溶液去除雜交膜上的探針，保留在膜上的文庫DNA模板可 多次用于不同探針的膜雜交，從而極大提高了宏基因組文庫的篩選效率。具體實施例方式下面結合本專利技術的實施例進一步來說明本專利技術的實質性內容，但并不以此限定本 專利技術實施例1:本專利技術的宏基因組文庫的高效保存和篩選方法可概括為取1 100微升的文庫 包裝顆粒與1 10毫升感受態細胞混勻，25 39°C保溫20 60分鐘，將該細胞混合物等 分成96份或96的整倍數，每份加少量培養液在28 39°C振蕩培養12 24小時，加入甘 油保存。多次膜雜交篩選宏基因組文庫，用含0.2M氫氧化鈉加0. 十二烷基磺酸鈉的堿 性溶液在37 70°C漂洗雜交膜兩次，每次10 30分鐘，去除探針的同時保留膜上的DNA 模板用于不同探針的多次膜雜交，從而提高宏基因組文庫的篩選效率。具體地挑取前一天劃線培養的EPI300單克隆至5毫升LB培養基中，37°C下每 分鐘200轉培養12小時；按1 10的比例轉接至15毫升新鮮LB培養液，再加IOmM硫酸 鎂，37°C下每分鐘200轉培養100分鐘使細胞密度達到OD6tltl約0. 9，由此獲得感受態細胞； 取30微升文庫包裝顆粒與1毫升感受態細胞混勻，37°C保溫30分鐘；將細胞混合物按每份 約10微升分裝成96小份(另取10微升用于稀釋涂布平板計數克隆)，每份加入2毫升LB 培養液，再加氯霉素12. 5微克/毫升，37°C下每分鐘200轉培養18小時；離心收集菌體，用 200微升20%甘油(以體積/體積為單位)，懸浮，對應轉移到96孔板中，液氮速凍后保存 于零下80°C。通過計數平板上的克隆，推測文庫每個保存孔的平均克隆數為244個。實施例2:挑取前一天劃線培養的EPI300單克隆至5毫升LB培養基中，37°C下每分鐘200 轉培養15小時；按1 10的比例轉接至15毫升新鮮LB培養液，添加IOmM硫酸鎂，37°C下 每分鐘200轉培養110分鐘使細胞密度達到OD6tltl約1. 0，由此獲得感受態細胞；取50微升 文庫包裝顆粒與5毫升感受態細胞混勻，30°C保溫60分鐘；將細胞混合物按每份約50微升 分裝成96小份(另取50微升用于稀釋涂布平板計數克隆)，轉移到每孔含0. 2毫升LB培 養液，添加氯霉素12. 5微克/毫升的96孔培養板，37°C下每分鐘230轉培養21小時，加入 甘油至終濃度15% (以體積/體積為單位)，液氮速凍后保存于零下35°C。通過計數平板 上的克隆，推測文庫每個保存孔的平均克隆數為526個。對于庫容量為一百萬個克隆的宏基因組文庫，按每孔平均克隆數333個計算，大 約只需30塊96孔保存板，既節省超低溫冰箱的保存空間，又無需費時費力地逐個挑取單克 隆，從而達到了快速有效地保存宏基因組文庫的目的。實施例3:多次膜雜交篩選宏基因組文庫已進行過探針雜交的雜交膜放入預熱的0. 2M氫氧化鈉加0. 十二烷基磺酸鈉溶液中，在37°C、55°C、68°C漂洗兩次，每次10分鐘、20分鐘、30分鐘，然后用300mM氯化鈉 加30mM檸檬酸鈉溶液徹底漂洗。通過檢測不同處理條件下探針洗脫的效果(表1)，發現 68°C每次30分鐘處理可完全去除探針。將去除探針的雜交膜用同一探針再次雜交，得到相 同的特異顯色點，說明洗脫探針的同時保留了膜上的DNA模板。雜交膜上已有的探針被有 效地去除之后，可對同一張膜用不同探針進行多次雜交，從而顯著提高宏基因組文庫的篩 選效率。實驗發現，同一張膜可進行多達七次的膜雜交篩選，視文庫DNA的濃度而定。表1本專利技術洗脫探針的處理條件溫度 Wm (分鐘)“是否去除探IF 10; 20; 30^本文檔來自技高網...
【技術保護點】
宏基因組文庫的保存和篩選方法，其特征在于所述宏基因組文庫的保存是用小量的文庫包裝顆料感染感受態細胞，保溫后將其等分成９６份或９６的整倍數，振蕩培養，加入甘油保存；所述宏基因組文庫的篩選是用氫氧化鈉加十二烷基磺酸鈉溶液漂洗雜交膜，去除探針的同時保留膜上的ＤＮＡ模板用于不同探針的多次膜雜交。
【技術特征摘要】
宏基因組文庫的保存和篩選方法，其特征在于所述宏基因組文庫的保存是用小量的文庫包裝顆料感染感受態細胞，保溫后將其等分成96份或96的整倍數，振蕩培養，加入甘油保存；所述宏基因組文庫的篩選是用氫氧化鈉加十二烷基磺酸鈉溶液漂洗雜交膜，去除探針的同時保留膜上的DNA模板用于不同探針的多次膜雜交。2.根據權利要求1所述的宏基因組文庫的保存和篩選方法，其特征在于所述宏基因組 文庫的保存是取1 100微升的文庫包裝顆粒與1 10毫升感受態細胞混勻，25 39°C保 溫20 60分鐘，將該細胞混合物等分成96份或96的整倍數，每份加0. 2~2ml LB培養液， 所述LB培養液為胰蛋白胨10克/升+酵母提取物5克/升+氯化鈉5克/升，pH7. 0，在 28 39°C振蕩培養12 24小時，加入甘油保存；所述宏基因組文庫的篩選是把已進行過 探針雜交的雜交膜放入預熱的0. 2M氫氧化鈉加以重量/體...
【專利技術屬性】
技術研發人員：曾英，付小莉，王浩鑫，
申請(專利權)人：中國科學院昆明植物研究所，
類型：發明
國別省市：53[中國|云南]
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