一種羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖及其制備方法和應用技術

本發明專利技術公開了一種屬于胞外多糖改性技術領域的羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖及制備方法。該胞外多糖的紅外光譜中存在１６００波數和１４２０波數的羧甲基中ＣＯＯ－的對稱和反對稱伸縮震動特征峰，羧甲基含量為１０％－２１％，取代度為０．３５％－０．７２％，重均分子量為（０．８－１．２）×１０５Ｄａ。其制備方法如下：將雙歧桿菌胞外多糖與氯乙酸在ＮａＯＨ水溶液中反應后，用冰乙酸中和至ｐＨ為７．０，然后經過濾、透析、濃縮、沉淀和洗滌而得到羧甲基雙歧桿菌胞外多糖。本發明專利技術還公開了羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖在制備免疫力調節保健品或藥物中的應用。該羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的體外實驗表明該胞外多糖可以顯著提高小鼠脾細胞中ＩＬ－２、ＩＦＮγ細胞因子的水平，免疫調節力明顯高于未改性的雙歧桿菌胞外多糖。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于胞外多糖改性
，具體涉及一種羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖及 其制備方法和它的應用。
技術介紹
雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)具有公認的安全性，是健康動物消化道內的優勢 菌群，資源豐富，種類繁多，并對宿主發揮生物屏障、營養、免疫、控制內毒素血癥、延緩衰 老、抗腫瘤等生理作用。隨著研究日漸深入，人們發現，雙歧桿菌的許多表觀特性及功能都 與其代謝產物有關，對其代謝產物進行研究具有十分重要的意義。多糖是指由20個以上單糖組成的糖類化合物，是生物體重要的生物大分子之一， 因其多變的結構而成為一種最具魅力的信息載體，具有免疫調節、抗腫瘤、抗衰老、降血脂、 降血糖、抗炎、抗病毒等生理功能，并逐漸成為現代生物、醫藥、食品、化工行業的研究開發 重點，具有很大的發展潛力。其中，免疫調節類多糖是研究最多、臨床應用最廣的多糖，也是 最具開發應用潛力的多糖。乳酸菌胞外多糖具有抗腫瘤、免疫調節等生理活性，不僅對乳制品的質構和風味 具有重要影響，而且有可能成為保健食品的一個良好來源，廣泛應用于各種食品的增稠、穩 定、乳化、膠凝及保濕。雙歧桿菌是乳酸菌的一種，具有很高的安全性和應用潛力，胞外多糖 (exopolysaccharide,EPS)是其重要的代謝產物之一，為了提高和保護多糖活性，其結構修 飾方面的研究也有了很大的進展。對于多糖生理活性的修飾主要包括主鏈的部分降解、硒 酸酯化、硫酸酯化、部分乙酰化、羧甲基化、羧乙基化、多羥基化、支鏈修飾等。隨著現代生物 技術的發展，基因工程技術、酶法技術和部分物理手段也被用來對多糖結構進行修飾，以增 強其生理活性，尤其在免疫增強和抗腫瘤方面研究較為深入。例如，Jamas等向一株野生酵 母菌引入外源基因，使其胞內多糖結構發生變化，支鏈糖基取代度從0. 2提高到0. 5，且空 間構象變得更為舒展，單螺旋結構的比例提高，多糖體外抗腫瘤活性比修飾前提高35倍左 右；Stahmarm等報道，一種具有β _1，3-D-葡聚糖結構的真菌多糖經過長時間的超聲處理 后，分子量從25萬降至5萬左右，經小角度X光衍射分析，其超聲降解產物的空間結構與具 有免疫調節活性的裂褶多糖相似；Demleitner等以curdlan為研究對象，進行了以D-半乳 糖、D或L-阿拉伯糖以及它們各自的低聚糖為取代基的支鏈修飾，并分別研究其抗腫瘤活 性，結果表明，D-葡萄糖為支鏈的curdlan衍生物活性最高。由于經過修飾能夠提高多糖活性，所以，此方面的研究逐漸成為近幾年國內外關 注的焦點。此項技術的國內外專利授權情況如下硫酸酯化枸杞多糖，硫酸酯化姬松茸多糖，硫酸酯化苦瓜多糖，硫酸酯化云芝多糖 和硫酸酯化茶樹菇多糖均已有專利申報，例如，閆紅、易劍平“硫酸酯化多糖及其制備方法 和應用”(申請號=200510098339. 0)。2006年，意大利的喬治·佐派蒂、帕斯夸·安娜·奧雷斯特等申請的專利“K5多糖 高硫酸化衍生物及其制備方法”(申請號=200610127561. 3)通過異丙醇處理和消除親油物質提純大腸桿菌K5多糖，純化的產物經過N-脫乙酰化作用后可用來制備硫酸化程度高的 新型N，0-硫酸化多糖。國內也有多糖硫酸酯化的報道。2004年，鄭維發、儲成才，“新月菱形藻胞外多糖硫 酸酯及其制備方法與應用”(申請號=200410090619. 2)中先將新月菱形藻胞外多糖先與甲 酰胺混合，然后加入酯化試劑在冰浴條件下進行酯化反應，將反應物中和至PH6. 8 7. 2， 用有機溶劑沉淀，所得沉淀溶解、透析即得新月菱形藻胞外多糖硫酸酯，并證明該胞外多糖 硫酸酯免疫調節活性有了顯著的提高，對病毒性肺炎和腫瘤的形成有明顯的抑制作用。隨著生理功能構效研究方面的發展，其他改性手段也逐漸引入該
2004年，在劉建林、趙雪松，“硒酸酯多糖制備新工藝”(申請號=200410067065. 4)中 將卡拉膠進行硒酸酯化，形成了一種有機硒閾值穩定在50-100mg/g的硒化卡拉膠 (Kappa-Selenocarrageenan)，控制了重復抱團現象，形成了一維納米結晶，磺酸基團完全 被亞硒酸基團修飾，降低了生物毒性，該專利技術合成的硒酸酯多糖，具有毒性小、生物利用度 高的特點；2004年，孟晟、鐘偉在“一種磷脂基團修飾的多糖或其衍生物的合成方法”(申 請號=200410054022. 2)中報道了將磷酰膽堿等具有仿生功能的基團通過縮合反應，共價 鍵合到天然的、生物可降解的天然多糖分子鏈上，制備得一種含有以磷脂基團修飾的新型 多糖材料；2004年，于廣利在“一種灰樹花多糖硫酸酯及其制備方法與應用”(申請號 200410023856. 7)中將灰樹花水不溶性多糖懸浮于有機溶劑中，加入堿液醚化，加入氯乙 酸，控溫進行硫酸酯化反應制備得到的羧甲基衍生物水溶性好，結構獨特，價格便宜，可用 于制備免疫調節劑和抗腫瘤藥物。但是有關雙歧桿菌胞外多糖及其改性產品的研究報道非 常少。本專利技術對雙歧桿菌胞外多糖改性，從而提供一種比未改性雙歧桿菌胞外多糖免疫調 節性更強的改性雙歧桿菌胞外多糖。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖。本專利技術的第二個目的在于提供上述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的制備方法。本專利技術的第三個目的在于提供一種含有上述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的組合 物。本專利技術的第四個目的在于提供上述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的應用。一種羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖，該胞外多糖的紅外光譜中存在1600波 數和1420波數的羧甲基中COO-的對稱和反對稱伸縮震動特征峰，上述羧甲基雙歧 桿菌胞外多糖中羧甲基含量為10% -21%，取代度為0. 35 % -0. 72%，重均分子量為 (0. 8-1. 2) X IO5Da0其制備方法如下(1)將雙歧桿菌胞外多糖溶于濃度為1. 5-2. OmoL/L的NaOH水溶液中，劇烈攪拌下 加入氯乙酸，于40-80°C繼續劇烈攪拌反應2-4h，其中，雙歧桿菌胞外多糖與氯乙酸的質量 比為 1 5-15 ；(2)冷卻步驟(1)的反應體系至室溫，用冰乙酸中和至pH為7. 0，過濾，濾液用自 來水透析2d-3d，再用蒸餾水透析ld-2d ；(3)濃縮透析液至原體積的1/2-1/5，然后加入4 5倍95%乙醇沉淀出胞外多 糖，再依次用無水乙醇、丙酮各洗滌沉淀2-3次，真空冷凍干燥沉淀得羧甲基雙歧桿菌胞外多糖。所述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的原料雙歧桿菌胞外多糖是通過發酵星狀雙 歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC No. 1355 而得到的。星狀雙歧桿菌 (Bifidobacterium asteroides)BM-10于2005年4月13日保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 1355。該菌株已在申請號為 200510105465. 4的專利中公開。有關利用該菌株發酵制備雙歧桿菌胞外多糖的方法參見申 請號為200510105465. 4的專利。步驟(1)中所述雙歧桿菌胞外多糖在NaOH水溶液中的濃度為4_20g/L。步驟(2)中透析所用透析袋的截留分子量為8000_12000Da。羧甲基雙歧本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖，其特征在于，所述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的紅外光譜中存在１６００波數和１４２０波數的羧甲基中ＣＯＯ－的對稱和反對稱伸縮震動特征峰，上述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖中的羧甲基含量為１０％－２１％，取代度為０．３５％－０．７２％，重均分子量為（０．８－１．２）×１０↑［５］Ｄａ。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳廣楓，李平蘭，林偉靜，旭日花，馬世敏，
申請(專利權)人：中國農業大學，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]