一種基于數字PCR平臺的食管癌基因檢測引物、探針及試劑盒制造技術

本發明專利技術公開了一種基于數字PCR平臺的食管癌基因檢測引物、探針及試劑盒，屬于分子生物學檢測技術領域。所述試劑盒至少包括食管癌基因檢測引物、探針序列，數字PCR反應預混液、引物混合液、探針混合液、超純水、陽性質控品、陰性質控品。檢測方法包括：待檢樣本核酸提取、檢測體系制備、微滴制備、芯片擴增、芯片閱讀、結果判定等步驟。本發明專利技術能夠快速、準確檢測出樣本中食管癌基因的生物標記物，醫生根據這些生物標記物判斷是否患有食管癌的風險；為醫生臨床診斷和治療提供了指導方案，同時也可在術后為患者實行動態監測。為患者實行動態監測。為患者實行動態監測。

【技術實現步驟摘要】
一種基于數字PCR平臺的食管癌基因檢測引物、探針及試劑盒


[0001]本專利技術涉及分子生物學檢測
，具體地說，涉及一種基于數字PCR平臺的食管癌基因檢測引物、探針及試劑盒。

技術介紹

[0002]食管癌(Esophagus cancer，EC)：是世界第六大致命癌癥，影響著全球45萬多人。在中國，EC是每年癌癥相關死亡的第四大原因。EC常見的臨床和病理分型包括鱗狀細胞癌和腺癌，約占食管癌的95％以上，其中鱗癌所占比例達到93％，腺癌只占很小比例，剩余5％為非常少見的食管惡性腫瘤，如食管的神經內分泌瘤、黑色素瘤等。食管癌的高發病率與吸煙、喝熱茶和口腔健康等許多因素都一定的相關性。
[0003]當前診斷EC的常用方法是纖維胃鏡、鋇劑檢查、計算機斷層掃描(CT)。但這些診斷方法耗時、費用高，且不能在早期準確診斷。因此，需要制定有效的診斷和治療方法，利用分子標記的手段特異性識別食管癌基因上的關鍵生物標記物，做到早篩干預和術后動態監測。

技術實現思路

[0004]針對現有技術存在的不足之處，本專利技術提供一種能夠在短時間內準確檢測出樣本中食管癌基因的生物標記物。通過食管癌基因的檢測，提高易感人群自身患癌額風險認識，具有一定的檢測預防意義；對于早期檢測發現的食管癌，也能做到早發現、早治療，提高患者生存率。
[0005]本專利技術解決技術問題采用如下技術方案：
[0006]一種基于數字PCR平臺的食管癌基因的生物標記物檢測的對應檢測引物、探針序列包括以下一組或多組任意組合：
[0007](1)正向引物:5'
?
GCTGTGAGCTCTGCTCTGAA
?
3',
[0008]反向引物：5'
?
CGGATGTCGTTCCTCTCCAG
?
3',
[0009]探針:5'
?
FAM
?
ACGGCTGCCTCAAGTGCTCACCCAA
?
BHQ1
?
3'；
[0010](2)正向引物:5'
?
GGGTTTCCTGTTCCTCCTTCTG
?
3',
[0011]反向引物：5'
?
AGTAGCCTTTTCCAGCAACAC
?
3',
[0012]探針:5'
?
VIC
?
TCGGCCTGACCCAGCCCCCAT
?
BHQ1
?
3'；
[0013](3)正向引物：5'
?
TGTGACACTGGATGGAGGGA
?
3',
[0014]反向引物：5'
?
CGTGGGTGAGTGTCAGGATG
?
3',
[0015]探針:5'
?
ROX
?
CTTGTTCACCTGCAGAAATGGGACGG
?
BHQ2
?
3'；
[0016](4)正向引物：5'
?
GATCGCCATGACGCTGGAAG
?
3',
[0017]反向引物：5'
?
AACTTGGCCGACTCGTACAC
?
3',
[0018]探針:5'Atto 425
?
TGCGACAACGCGGCGCAGAA
?
BHQ1
?
3'；
[0019](5)正向引物：5'
?
TGCATCCGAGCCTTCTGC
?
3',
[0020]反向引物：5'
?
CTGTCTCTTCCTCACGCTGG
?
3',
[0021]探針:5'CY5.5
?
CCCAGCGGTGCCTGAACCCAG
?
BHQ3
?
3'；
[0022](6)正向引物：5'
?
AGGTCCACTGACACGTT
?
3',
[0023]反向引物：5'
?
GCCTCAAGATCATCAGCAAT
?
3',
[0024]探針:5'
?
CY5
?
ACCACAGTCCATGCCATCACTGCC
?
BHQ1
?
3'。
[0025]同時，本專利技術提供一種基于數字PCR平臺的食管癌基因檢測試劑盒，所述試劑盒包括數字PCR反應預混液、引物混合液、探針混合液、超純水，其中，所述引物混合液包括權利要求1所述的一種或多種引物對、探針混合液包括引物對所對應的探針。
[0026]其中，所述試劑盒還包括陽性質控品、陰性質控品，所述陰性質控品是無核酸水，陽性質控品是人工合成的食道癌靶標基因核酸片段。
[0027]其中，所述Tris
?
HCl為20mM、dNTP為200nM、DNA聚合酶為1.0u/uL、MgCl2為5mM、逆轉錄酶為200u/uL。
[0028]一種基于數字PCR平臺的食管癌基因檢測方法，包括以下步驟：
[0029](1)待檢樣本核酸提取；使用The RNeasy FFPE Kit ofQiagen提取石蠟切片樣本，獲得核酸溶液；
[0030](2)檢測體系制備：檢測體系制備包括權利要求1所述的食管癌基因對應檢測引物混合液、探針混合液，數字PCR反應預混液、陽性對照和陰性對照。其中，食管癌基因對應檢測引物、探針序列配制的混合體系，不加待檢核酸和陰陽質控品的為體系P1。
[0031](3)微滴制備；將體系P1加入步驟(1)中的待檢樣本核酸溶液、步驟(2)中的陰性對照或陽性對照，振蕩混勻，離心后采用微滴制備儀獲得微滴芯片；
[0032](4)芯片擴增；將步驟(3)獲得的微滴芯片放入芯片擴增儀，對其核酸樣本進行擴增；
[0033](5)芯片閱讀；指通過芯片閱讀軟件完成芯片閱讀，并通過熒光通道的數值判定待檢樣本含量；根據樣本含量判定是否含有食管癌基因。
[0034]其中，所述芯片擴增的擴增程序為：50℃15min；85℃5min；{95℃15s，60℃30s}*40cycles；25℃50s；25℃10s；擴增時間60min。
[0035]其中，所述數字PCR反應預混液體積比占比20％、引物混合液引物濃度10mM，含量體積比占比13.33％，探針混合液的探針濃度為10mM，體積占比6.67％、超純水體積占比26.67％、待檢樣本核酸體積占比33.33％。
[0036]有益效果
[0037]1、本專利技術檢測食管癌基因的生物標記物檢測的對應檢測引物、探針序列準確，對食道癌基因的識別檢測率高。<本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種基于數字PCR平臺的食管癌基因檢測引物和探針，其特征在于，所述食管癌基因對應檢測引物、探針序列包括以下一組或多組任意組合：(1)正向引物:5'
?
GCTGTGAGCTCTGCTCTGAA
?
3',反向引物：5'
?
CGGATGTCGTTCCTCTCCAG
?
3',探針:5'
?
FAM
?
ACGGCTGCCTCAAGTGCTCACCCAA
?
BHQ1
?
3'；(2)正向引物:5'
?
GGGTTTCCTGTTCCTCCTTCTG
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3',反向引物：5'
?
AGTAGCCTTTTCCAGCAACAC
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3',探針:5'
?
VIC
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TCGGCCTGACCCAGCCCCCAT
?
BHQ1
?
3'；(3)正向引物：5'TGTGACACTGGATGGAGGGA
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3',反向引物：5'
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CGTGGGTGAGTGTCAGGATG
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3',探針:5'
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ROX
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CTTGTTCACCTGCAGAAATGGGACGG
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BHQ2
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3'；(4)正向引物：5'GATCGCCATGACGCTGGAAG
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3',反向引物：5'AACTTGGCCGACTCGTACAC
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3',探針:5'Atto425
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TGCGACAACGCGGCGCAGAA
?
BHQ1
?
3'；(5)正向引物：5'TGCATCCGAGCCTTCTGC
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3',反向引物：5'CTGTCTCTTCCTCACGCTGG
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3',探針:5'CY5.5
?
CCCAGCGGTGCCTGAACCCAG
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BHQ3
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3'；(6)正向引物：5'
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AGGTCCACTGACACGTT
?
3',反向引物...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張鴻，高軒，江靜，王成，
申請(專利權)人：蕪湖胤星醫學檢驗實驗室有限公司，
類型：發明
國別省市：