一種針對ARPC5基因、抑制腫瘤增殖和轉移的shRNA及其應用制造技術

本發明專利技術涉及針對ARPC5基因、抑制腫瘤增殖和轉移的shRNA，其堿基序列如SEQ ID No.1所示，即：5

【技術實現步驟摘要】
一種針對ARPC5基因、抑制腫瘤增殖和轉移的shRNA及其應用


[0001]本專利技術屬于生物
,涉及一個能通過RNA干擾途徑特異降低細胞內ARPC5基因表達量的發夾型小干擾RNA(ARPC5 shRNA)的序列；以及利用這種發夾型小干擾RNA(shRNA)對ARPC5基因進行特異性干擾后抑制細胞增殖和轉移的作用，尤其是抑制肝癌細胞系(HepG2)增殖和轉移的作用。

技術介紹

[0002]癌癥患者發生轉移是死亡的重要原因，腫瘤細胞侵襲周圍組織是腫瘤發生轉移的先決條件。侵襲細胞遷移需要細胞本身形成特殊結構，包括侵襲性偽足。侵襲性偽足的形成主要依賴于肌動蛋白聚合，由于聚合的調控與ARP2/3復合體息息相關，因此越來越多的研究者關注于肌動蛋白聚合調控因子ARP2/3復合體在腫瘤細胞中的作用。
[0003]深入研究侵襲性偽足形成及調控機制對于以腫瘤轉移為靶點的新型抗代謝藥物的研發至關重要。
[0004]ARPC5是一個新近發現的基因，越來越多的研究著眼于ARP2/3復合體的最小亞基ARPC5。在肝細胞癌多株細胞系中下調其靶基因ARPC5可以導致其細胞骨架肌動蛋白重組，表現為細胞變圓及空泡狀細胞形態，最終導致癌細胞侵襲及遷移能力下降。作為癌基因的ARPC5可能參與了腫瘤侵襲轉移機制的調控，其在腫瘤中的研究越來越受關注。
[0005]ARPC5是由155個氨基酸構成，分子量為16kDa。目前認為ARPC5蛋白與腫瘤增殖及轉移呈正相關。其中ARPC5在腫瘤基因組圖譜TCGA數據庫中顯示肝癌高表達，并且ARPC5表達越高，預后越差。
[0006]最近的研究結果表明，ARPC5在促進腫瘤細胞增殖和黏附侵襲的過程中發揮重要作用。因此，抑制ARPC5基因的轉錄和表達可能是抑制腫瘤細胞增殖和轉移的有效方法。
[0007]shRNA(short hairpin RNA)是“短發夾RNA”，shRNA包括兩個短反向重復序列，中間由一莖環(loop)序列分隔的，組成發夾結構，由polⅢ啟動子控制。隨后再連上5
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6個T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉錄終止子。利用shRNA干涉基因可以克服siRNA作用時間短暫的缺點，是一種穩定沉默基因的方法。

技術實現思路

[0008]本專利技術的目的是提供一種針對ARPC5基因、抑制腫瘤增殖和轉移的shRNA及其應用，該shRNA可以特異性抑制人ARPC5基因表達。
[0009]本專利技術的技術解決方案是：一種針對ARPC5基因、抑制腫瘤增殖和轉移的shRNA，其堿基序列如SEQ ID No.1所示，即：5
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CCGGGUCCAUUGUUCGUGUCUUGAC CUCGAGGUCAAGACACGAACAATGGACUUUUU
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。
[0010]前述針對ARPC5基因、抑制腫瘤增殖和轉移的shRNA，針對的靶序列如SEQ ID No.2所示，即GUCCAUUGUUCGUGUCUUGAC。
[0011]前述shRNA通過如SEQ ID No.3或4所示的DNA寡核苷酸鏈轉錄生成，即
[0012]5’?
CCGGGTCCATTGTTCGTGTCTTGACCTCGAGGTCAAGACACGAACAATGGACTTTTT
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或
[0013]5’?
AATTAAAAAGTCCATTGTTCGTGTCTTGACCTCGAGGTCAAGACACGAACAATGGAC
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[0014]前述該shRNA通過包含如SEQ ID No.3或4所示的DNA寡核苷酸鏈的質粒轉錄生成。
[0015]前述shRNA在制備抑制腫瘤細胞增殖和轉移的藥物中的應用。
[0016]將本專利技術發夾型干擾RNA(ARPC5 shRNA)轉染入人肝癌細胞系后，ARPC5基因和蛋白的表達量明顯降低，并能抑制細胞增殖能力，黏附能力和侵襲能力，并且能抑制細胞在裸鼠皮下瘤的增長，具有潛在的治療腫瘤的價值。這段shRNA能夠通過RNA干擾途徑(RNAi)，特異性降低人肝癌細胞系(HepG2)中基因ARPC5的表達，從而顯著抑制HepG2細胞的增殖和轉移。該發夾小RNA可以應用于抑制腫瘤細胞增殖和轉移的藥物中。
附圖說明
[0017]圖1是實驗流程圖。
[0018]圖2是RT
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PCR檢測ARPC5基因shRNA轉染人肝癌細胞系HepG2，ARPC5基因mRNA水平的RT
?
PCR結果，ARPC5 shRNA為轉染ARPC5 shRNA的細胞，control shRNA為轉染無關序列shRNA的細胞。
[0019]圖3是Western
?
blot檢測ARPC5基因shRNA轉染人肝癌細胞系HepG2，ARPC5基因蛋白表達水平，ARPC5 shRNA為轉染ARPC5 shRNA的細胞，control shRNA為轉染無關序列shRNA的細胞。
[0020]圖4是細胞計數檢測ARPC5基因shRNA轉染后，細胞增殖能力的變化。
[0021]圖5是細胞黏附實驗檢測ARPC5基因shRNA轉染后，細胞黏附能力的變化。
[0022]圖6是細胞侵襲實驗檢測ARPC5基因shRNA轉染后，細胞侵襲能力的變化。
[0023]圖7是裸鼠皮下瘤實驗檢測ARPC5基因shRNA轉染后，細胞接種皮下瘤增殖速度的變化。
[0024]圖8是裸鼠皮下瘤實驗檢測ARPC5基因shRNA轉染后，細胞接種皮下瘤增殖水平的變化。
[0025]圖9是細胞免疫熒光實驗檢測ARPC5基因shRNA轉染后，細胞骨架微絲網絡的變化圖一。
[0026]圖10是細胞免疫熒光實驗檢測ARPC5基因shRNA轉染后，細胞骨架微絲網絡的變化圖二。
具體實施方式
[0027]實驗流程如圖1所示：
[0028]1.針對ARPC5基因shRNA的設計與合成：根據ARPC5基因全長mRNA序列，經分析設計，我們選擇了ARPC5基因全長mRNA序列(BC057237)第528～548堿基處，共21個核苷酸為靶向干涉的序列，被識別的具體序列如SEQ ID No.2所示，即：GCAAGAAGAAGTGTGGTCACA。針對該序列我們設計合成了一段高特異性的shRNA，該shRNA通過如SEQ ID No.3或4所示的DNA寡核苷酸鏈轉錄生成，即
[0029]5’?
CCGGGTCCATTGTTCGTGTCTTGACCTCGAGGTCAAGACACGAACAATGGACTTTTT
?3’
或
[0030]5’?
AATTAAAAAGTCCATTGTTCGTGTCTTGACCTCGAGGTCAAGACACGAACAATGGAC
?3’
轉錄后
的shRNA堿基序列如SEQ ID No.1所示，即：5
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【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種針對ARPC5基因、抑制腫瘤增殖和轉移的shRNA，其特征在于，其堿基序列如SEQ ID No.1所示，即：5
’?
CCGGGUCCAUUGUUCGUGUCUUGACCUCGAGGUCAAGACACGAACAATGGACUUUUU
?3’
。2.根據權利要求1所述的shRNA，其特征在于：其針對的靶序列如SEQ ID No.2所示，即GUCCAUUGUUCGUGUCUUGAC。3.根據權利要求1或2所述的shRNA，其特征在于：該shRNA通過如SEQ ID No.3或4所示的DNA寡核苷酸鏈轉錄生成，即5
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【專利技術屬性】
技術研發人員：南剛，
申請(專利權)人：中國人民解放軍空軍軍醫大學，
類型：發明
國別省市：