用于核酸酶介導(dǎo)的基因組工程改造的遞送方法和組合物技術(shù)

本公開(kāi)內(nèi)容涉及基因組工程領(lǐng)域，特別是細(xì)胞的基因組的靶向修飾，在此公開(kāi)了用于核酸酶介導(dǎo)的基因組工程改造的遞送方法和組合物。介導(dǎo)的基因組工程改造的遞送方法和組合物。介導(dǎo)的基因組工程改造的遞送方法和組合物。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
用于核酸酶介導(dǎo)的基因組工程改造的遞送方法和組合物
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)主張2013年10月17日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.61/892,348和2014年8月5日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.62/033,424的權(quán)益，所述申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容以其全文引用的方式并入本文。


[0003]本公開(kāi)內(nèi)容涉及基因組工程領(lǐng)域，特別是細(xì)胞的基因組的靶向修飾。
[0004]專利技術(shù)背景
[0005]已描述用于基因組DNA的靶向切割的各種方法和組合物。可使用這些靶向切割事件，例如，引起靶向突變，引起細(xì)胞DNA序列的靶向缺失，及促使在預(yù)定染色體基因座靶向重組。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.8,586,526；8,329,986；8,399,218；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美國(guó)專利公開(kāi)20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960及美國(guó)申請(qǐng)No.14/278,903，所述專利申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容針對(duì)所有目的以其全文引用的方式并入本文。
[0006]這些方法通常涉及使用工程改造的切割系統(tǒng)以引起雙鏈斷裂(DSB)或靶DNA序列缺口，因此，通過(guò)產(chǎn)生錯(cuò)誤的過(guò)程諸如非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)斷裂或使用修復(fù)模板(同源導(dǎo)向的修復(fù)或HDR)修復(fù)可導(dǎo)致基因敲除或受關(guān)注的序列插入(靶向整合)。可通過(guò)使用特定核酸酶諸如工程改造的鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)，使用以工程改造的crRNA/tracr RNA(
‘
單導(dǎo)向RNA
’
)導(dǎo)引特定切割的CRISPR/Cas系統(tǒng)和/或使用基于Argonaute系統(tǒng)的核酸酶(例如，從高度好熱菌得到，稱為
‘
TtAgo
’
,(Swarts等人(2014)Nature 507(7491):258
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261)，進(jìn)行切割。
[0007]使用一種上述核酸酶系統(tǒng)的靶向切割可采用HDR或NHEJ介導(dǎo)的過(guò)程中任何一種過(guò)程用于將核酸插入到特定靶位置。然而，將核酸酶系統(tǒng)和供體同時(shí)遞送到細(xì)胞可能是問(wèn)題所在。例如，通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)體進(jìn)入到細(xì)胞中來(lái)遞送供體或核酸酶可能對(duì)受體細(xì)胞，尤其對(duì)為初級(jí)細(xì)胞且不如來(lái)自細(xì)胞系的細(xì)胞強(qiáng)健的細(xì)胞有毒。
[0008]CD34+干細(xì)胞或祖細(xì)胞是特征為其自我更新和/或分化為淋巴細(xì)胞(例如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞)和髓系(例如單核細(xì)胞、紅血球、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞)能力的異質(zhì)性細(xì)胞組。其異質(zhì)性源自CD34+干細(xì)胞群體中存在多個(gè)常反映特定群的多能性(不論定向的譜系)的子群的事實(shí)。例如，為CD38
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的CD34+細(xì)胞是較為原始的未成熟的CD34+祖細(xì)胞(也稱為長(zhǎng)期造血祖細(xì)胞)，而那些為CD34+CD38+的細(xì)胞(短期造血祖細(xì)胞)是定向的譜系(參見(jiàn)Stella等人(1995)Hematologica 80:367
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387)。當(dāng)這一群體接著進(jìn)一步以分化途徑發(fā)展時(shí)，CD34標(biāo)記物失去。CD34+干細(xì)胞在臨床細(xì)胞療法中具有巨大的潛力。然而，部分地歸因於其異質(zhì)性，可能難以在細(xì)胞上進(jìn)行基因操作，諸如基因敲除、轉(zhuǎn)基因插入等。具體來(lái)說(shuō)，這些細(xì)胞通過(guò)常規(guī)的遞送載體轉(zhuǎn)導(dǎo)是不充分的，最原始的干細(xì)胞對(duì)修飾敏
感，在引起的DNA DSB后，HDR受到限制，及在延長(zhǎng)時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件中HSC維持不足。另外，其它受關(guān)注的細(xì)胞(僅舉非限制性實(shí)例來(lái)說(shuō)，心肌細(xì)胞、中型棘突神經(jīng)元、初級(jí)肝細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞和肌細(xì)胞)轉(zhuǎn)導(dǎo)以進(jìn)行基因組編輯可能不如其它細(xì)胞成功。
[0009]因此，仍需要用于對(duì)CD34+細(xì)胞和其它受關(guān)注的毒性較小但更有效的細(xì)胞基因組工程改造的組合物和方法。
專利技術(shù)概要
[0010]本專利技術(shù)描述適用于基因療法和基因組工程改造中的組合物和方法。具體來(lái)說(shuō)，所述的方法和組合物涉及將核酸引入到細(xì)胞諸如初級(jí)細(xì)胞包括造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞(HSC/PC)和T細(xì)胞中。此外，本專利技術(shù)的方法和組合物適用于遞送包含受關(guān)注的供體DNA的AAV顆粒到這些細(xì)胞。
[0011]在一些方面，本專利技術(shù)包括出于基因組工程改造的目的而遞送至少一種核酸酶到細(xì)胞(例如，HSC/PC)。在一些實(shí)施方案中，核酸酶呈肽遞送，而在其它實(shí)施方案中，核酸酶呈編碼核酸酶的核酸遞送。在一些實(shí)施方案中，使用不只一種核酸酶。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼核酸酶的核酸為mRNA，及在一些情況中，mRNA經(jīng)過(guò)保護(hù)。核酸酶可包括鋅指核酸酶(ZFN)、TALE核酸酶(TALEN)或CRISPR/Cas或TtAgo核酸酶系統(tǒng)或其組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)電穿孔遞送編碼核酸酶的核酸。
[0012]一方面，本文提供一種將一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因整合到分離的細(xì)胞的基因組中的方法，所述方法包括按順序?qū)⑥D(zhuǎn)基因和至少一種核酸酶引入到細(xì)胞中以使核酸酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的靶向整合。因此，在某些方面，提供一種將一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因整合到分離的細(xì)胞的基因組中的方法，所述方法包括：將(a)包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因的供體載體和(b)至少一種核酸酶引入到細(xì)胞中，其中所述至少一種核酸酶切割細(xì)胞的基因組以使所述一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因整合到細(xì)胞的基因組中，及進(jìn)一步地，其中(i)如果供體載體先于所述至少一種核酸酶之前被引入到細(xì)胞中，則在引入供體載體后的48小時(shí)內(nèi)引入所述至少一種核酸酶到細(xì)胞中；及(ii)如果所述至少一種核酸酶先于供體載體被引入，則在引入所述至少一種核酸酶后的4小時(shí)內(nèi)引入所述供體載體到細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，所述方法可以包括(a)將包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因的供體載體引入到細(xì)胞中；(b)培養(yǎng)所述細(xì)胞48小時(shí)以下(例如，幾秒到48小時(shí)或其間的任何時(shí)間)；及(c)將至少一種核酸酶引入到所述細(xì)胞中，其中所述至少一種核酸酶切割所述細(xì)胞的基因組以使所述一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因被整合到所述細(xì)胞的所述基因組中。或者，所述方法可以包括：(a)將至少一種核酸酶引入到細(xì)胞中；(b)培養(yǎng)所述細(xì)胞24小時(shí)以下(例如，幾秒到24小時(shí)或其間的任何時(shí)間)；及(c)將包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因的供體載體引入到所述細(xì)胞中，其中所述至少一種核酸酶切割所述細(xì)胞的基因組以使所述一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因被整合到所述細(xì)胞的所述基因組中。可以重復(fù)所述方法步驟以將額外的轉(zhuǎn)基因整合到相同和/或不同的基因座中。在某些實(shí)施方案中，將所述細(xì)胞培養(yǎng)(步驟(b))24小時(shí)以下(例如，幾秒到24小時(shí)或其間的任何時(shí)間)。在其它的實(shí)施方案中，例如，當(dāng)核酸酶在引入供體載體之前被引入時(shí)，將所述細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)以下。
[0013]可以使用任何細(xì)胞，例本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種切割內(nèi)源AAVS1基因的核酸酶，所述核酸酶包含DNA結(jié)合域、切割域和結(jié)合SEQ ID NO:27和/或SEQ ID NO:28中所示的靶位點(diǎn)的單鏈導(dǎo)引RNA(sgRNA)DNA
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結(jié)合域。2.如權(quán)利要求1所述的核酸酶，其中所述切割域來(lái)自核酸內(nèi)切酶。3.如權(quán)利要求1所述的核酸酶，其中所述切割域來(lái)自Cas蛋白和/或IIS型核酸內(nèi)切酶。4.一種組合物，包含：一種或多種如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的核酸酶；和包含外源序列的AAV載體，其中，所述外源序列在所述一種或多種核酸酶切割后整合到所述AAVS1基因內(nèi)。5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述外源序列編碼多肽。6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述多肽選自：抗體、抗原、酶、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞表面受體、細(xì)胞核受體、激素、淋巴細(xì)胞活素、細(xì)胞介素、受體，任何上述的功能性片段和上述的組合。7.如權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述外源序列選自：一種或多種shRNA、一種或多種RNAi分子、一種或多種miRNA，及其組合。8.如權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述外源...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：M，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：桑格摩生物科學(xué)股份有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：