本文公開用于將編碼涉及凝血的蛋白質的轉基因序列插入細胞的基因組中以治療包括血友病的病狀的方法和組合物。在一個方面，本文描述非天然存在的鋅指蛋白(ZFP)，該鋅指蛋白結合至基因組中所關注區域(例如白蛋白基因)中的靶位點，其中ZFP包含一個或多個工程化的鋅指結合結構域。在某些實施方案中，鋅指結構域識別白蛋白基因中的靶位點。在一些實施方案中，鋅指蛋白質包含稱為并且排序為F1至F5或F1至F6的五個或六個鋅指結構域，如表1的單行中示出。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】相關申請的交叉引用本申請要求2013年12月9日提交的美國臨時申請號61/913,838和2014年2月24日提交的美國臨時申請號61/943,884的權益，其公開內容全部以引用方式并入本文。在聯邦科研資助下進行的本專利技術權利的聲明不適用。
本公開是涉及基因修飾和血友病治療領域。背景血友病諸如甲型血友病和乙型血友病，是凝血系統的遺傳病癥，其特征是出血至關節和軟組織中，和過量出血至經歷外傷或經歷手術的任何位點。甲型血友病在臨床上與乙型血友病難分辨，但是因子VIII(FVIII或F8)在甲型血友病中缺乏或不存在，而因子IX(FIX或F.IX)在患有乙型血友病的患者中缺乏或不存在。因子VIII基因編碼血漿糖蛋白，所述血漿糖蛋白以其非活性形式與馮威勒布蘭德氏因子相關聯地進行循環。在表面損傷后，內在凝血級聯啟始并且因子VIII從復合物中釋放并且變得活化。活化形式與因子IX一起操作來激活因子X變成活化Xa，最后導致纖維蛋白原變化至纖維蛋白和凝結誘導。參見，Levinson等人(1990)Genomics7(1):1-11。40-50％的甲型血友病患者患有涉及因子VIII內含子22的染色體倒位(也稱為IVS22)。倒位的原因是因子VIII基因的內含子22中的9.6kb序列與位于因子
VIII基因遠側約300kb處的兩個密切相關反向序列中的一個之間的染色體內重組事件，導致相對于外顯子23至26的外顯子1至22倒位。參見，Textbook of Hemophilia,Lee等人(編)2005,Blackwell Publishing。其他甲型血友病患者在因子VIII中具有缺陷，包括活性位點突變，和無義和錯義突變。就其本身來說，因子IX(F.IX或FIX)編碼涉及凝血系統的絲氨酸蛋白水解酶中的一個，并且已經證明恢復野生型因子IX蛋白質的正常循環水平的甚至3％可預防自發出血。額外血友病與其他凝血因子的異常表達相關聯。舉例來說，因子VII缺陷是在300,000至500,000人中的約1個人中發生的常染色體隱性性狀并且與患者體內的不適當因子VII水平相關聯。類似地，因子X缺陷也是在每500,000至1百萬人中的1個人中發生的常染色體隱性性狀，并且由FX基因的遺傳變體導致。因子X缺陷可在患者群體中具有不同程度的嚴重性。乙型血友病的當前治療依賴于長期、重復靜脈內輸注純化重組因子IX并且受許多缺點影響。這包括需要重復靜脈內輸注，與抑制劑形成相關聯，并且是預防性而非治愈性的。已經描述患有甲型或乙型血友病的患者的基因療法，其涉及引入質粒和編碼功能因子VIII或因子IX蛋白質的其他載體(例如，AAV)。參見例如美國專利號6,936,243；7,238,346和6,200,560；Shi等人(2007)J Thromb Haemost.(2):352-61；Lee等人(2004)Pharm.Res.7:1229-1232；Graham等人(2008)Genet Vaccines Ther.3:6-9；Manno等人(2003)Blood 101(8):2963-72；Manno等人(2006)Nature Medicin e 12(3):342-7；Nathwani等人(2011)Molecular Therapy 19(5):876-85；Nathwani等人(2011)；N Engl J Med.365(25):2357-65。然而，在這些方案中，形成抑制性抗-因子VIII或IX(抗-F8或抗-F.IX)抗體和針對遞送媒介物的抗體仍然是血友病的基于因子VIII和因子IX替換的療法的主要并發癥。參見例如Scott&Lozier(2012)Br J Hae matol.156(3):295-302。已經描述基因組DNA的靶向裂解的各種方法和組合物。這些靶向裂解事件可用于例如誘導靶向誘變、誘導細胞DNA序列的靶向缺失，和促進預定染色體基因座處的靶向重組。參見，例如，美國專利號8,623,618；8,034,598；8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美國專利公布20030232410；20050208489；20050026157；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960和美國申請號14/278,903，其公開內容出于所有目的以引用方式全部并入。這些方法經常涉及使用工程化裂解系統來誘導雙鏈斷裂(DSB)或靶DNA序列中的切口以使得通過產生誤差的過程諸如非同源末端連接(NHEJ)來修復斷裂或使用修復模板的修復(同源性引導修復或HDR)可產生基因的剔除或插入所關注的序列(靶向整合)。此技術也可用于經由使用供體寡核苷酸來在基因組序列中引入位點特異性變化，包括引入基因組區域的特異性缺失，或特異性點突變或局部改變(也稱為基因校正)。裂解可經由使用特異性核酸酶諸如工程化鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化劑樣效應核酸酶(TAL EN)來發生，或使用具有工程化crRNA/tracr RNA(‘單一引導RNA’)的CRISPR/Cas系統來引導特異性裂解。此外，開發基于Argonaute系統(例如，來自嗜熱棲熱菌，被稱為‘TtAgo’，參見Swarts等人(2014)Nature 507(7491):258-261)的靶向核酸酶，所述系統還可具有用于基因組編輯和基因療法的潛力。如與典型整合方法相比，此核酸酶介導的靶向轉基因插入方法提供改進轉基因表達、增加安全和表達持久性的希望，因為它允許精確轉基因定位以將基因沉默或活化相鄰致癌基因的風險減少到最低限度。轉基因可靶向整合至其同源基因座中，例如，將野生型轉基因插入內源性基因座以校正突變基因。或者，轉基因可插入非同源基因座例如“安全港”基因座中。已經描述一些安全港基因座，包括CCR5、
HPRT、AAVS1、Rosa和白蛋白。參見，例如，美國專利號7,951,925和8,110,379；美國公布號20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960和美國申請號14/278,903。舉例來說，美國專利公布號20110027235涉及將功能性蛋白質靶向整合至分離干細胞中并且美國公布號20120128635描述治療乙型血友病的方法。也參見Li等人(2011)Nature 475(7355):217-221和Anguela等人(2013)Blood122:3283-3287。然而，仍然需要治療血友病的額外組合物和方法。概述本文公開用于靶向整合編碼蛋白質，諸如功能凝血因子蛋白質(例如，因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種鋅指蛋白，其包含稱為并且排序為F1至F5或F1至F6的五個或六個鋅指結構域，如在表1的單行中示出。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.12.09 US 61/913,838;2014.02.24 US 61/943,8841.一種鋅指蛋白，其包含稱為并且排序為F1至F5或F1至F6的五個或六個鋅指結構域，如在表1的單行中示出。2.一種融合蛋白，其包含如權利要求1所述的鋅指蛋白和野生型或工程化裂解結構域或裂解半結構域。3.一種多核苷酸，其編碼一種或多種如權利要求1或權利要求2所述的蛋白質。4.一種表達載體，其包含如權利要求3所述的多核苷酸。5.如權利要求4所述的表達載體，其中所述載體是AAV載體。6.如權利要求5所述的表達載體，其中所述AAV載體是AAV2/6載體。7.一種藥物組合物，其包含如權利要求4至6中任一項所述的表達載體。8.如權利要求7所述的藥物組合物，其包含如權利要求4至6中任一項所述的第一表達載體，所述第一表達載體包含第一多核苷酸，和如權利要求4至6中任一項所述的第二表達載體，所述第二表達載體包含第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸是不同的。9.如權利要求7所述的藥物組合物，其包含(i)包含編碼鋅指核酸酶的多核苷酸的AAV載體，所述鋅指核酸酶包含FokI裂解結構域和包含排序為F1至F5的5個鋅指結構域的鋅指蛋白質，其中每個鋅指結構域包含識別螺旋區域并且其中所述鋅
\t指蛋白質的所述識別螺旋區域在表1的第一行中示出(SEQ ID NO:4-8)；(ii)包含編碼鋅指核酸酶的多核苷酸的AAV載體，所述鋅指核酸酶包含FokI裂解結構域和包含排序為F1至F6的6個鋅指結構域的鋅指蛋白質，其中每個鋅指結構域包含識別螺旋區域并且其中所述鋅指蛋白質的所述識別螺旋區域在表1的第二行中示出(SEQ ID NO:9-14)；和(iii)包含編碼因子IX蛋白質的供體的AAV載體。10.如權利要求8所述的藥物組合物，其中所述第一多核苷酸包含如SEQ ID NO.15的序列或由如SEQ ID NO.15的序列組成并且所述第二多核苷酸包含如SEQ ID NO.16的序列或由如SEQ ID NO.16的序列組成。11.如權利要求10所述的藥物組合物，其進一步包含供體序列。12.如權利要求11所述的藥物組合物，其中所述供體序列與表達載體締合。13.如權利要求11所述的藥物組合物，其中所述供體序列包含如SEQ ID NO.17的序列或由如SEQ ID NO.17的序列組成。14.如權利要求13所述的藥物組合物，其中所述表達載體是AAV載體。15.如權利要求14所述的藥物組合物，其中所述AAV載體是AAV2/6載體。16.如前述權利要求中任一項所述的藥物組合物，其中至少一種蛋白質結合至細胞中的白蛋白基因。17.如前述權利要求中任一項所述的藥物組合物，其進一步包含
\t藥學上可接受的載體。18.一種裂解...
【專利技術屬性】
技術研發人員：J·C·米勒，D·帕斯喬恩，E·J·瑞巴，
申請(專利權)人：桑格摩生物科學股份有限公司，
類型：發明
國別省市：美國;US
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