O型口蹄疫病毒單克隆抗體及其應用制造技術

本發明專利技術提供了特異性結合SEA型O型口蹄疫病毒的單克隆抗體4E3和單克隆抗體4D5，以及以單克隆抗體4E3為包被抗體，以單克隆抗體4D5為酶標抗體的雙抗夾心試劑盒，本發明專利技術的試劑盒能定量檢測SEA型O型口蹄疫病毒樣顆粒含量，能檢測單苗、多價苗、或聯苗中SEA型O型口蹄疫病毒樣顆粒的含量；還能定量檢測半成品疫苗或成品疫苗中的抗原含量。疫苗中的抗原含量。疫苗中的抗原含量。

【技術實現步驟摘要】
O型口蹄疫病毒單克隆抗體及其應用


[0001]本專利技術涉及O型口蹄疫病毒單克隆抗體，具體為SEA型O型口蹄疫病毒單克隆抗體，分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞，以及含單克隆抗體對的雙抗體夾心檢測試劑盒和應用，屬于生物


技術介紹

[0002]口蹄疫是由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄動物易患的一種熱性、急性、高度接觸性傳染病。該病傳播迅速，發病率高，該病的爆發和流行給全球養殖業帶來了巨大的經濟損失，世界動物衛生組織(OIE)和聯合國糧農組織(FAO)將其列為A類烈性傳染病之首，我國將其列為一類傳染病第一位。
[0003]口蹄疫病毒有7個血清型(A、O、C、Asia I、SAT1、SAT2和SAT3型)，極易發生變異，且型與型之間無交叉免疫保護作用。其中我國主要流行O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒。疫苗免疫是控制此病、保護家畜免受危害的有效措施。目前用于預防口蹄疫的疫苗以全病毒滅活苗和合成肽疫苗為主，但全病毒滅活苗存在生物安全風險。病毒樣顆粒(VLPs)是一種在體外和/或體內表達時能夠自主包裝成病毒外殼結構的類病毒粒子，它們是具有病毒的相似外殼結構但不具有病毒復制能力的假病毒。VLPs疫苗能有效地激發機體產生抗感染，抗腫瘤免疫，基于病毒樣顆粒設計的疫苗是一種較為理想的疫苗形式。因此，安全有效的基于病毒樣顆粒的亞單位疫苗是目前研究的熱點。
[0004]目前口蹄疫O型流行毒株以SEA型和CATHAY型兩種拓撲型為主，因此，對口蹄疫O型病毒樣顆粒亞單位疫苗的研發也以上述拓撲型為主展開，研發中試、生產時最關鍵的技術要點是亞單位疫苗半成品、成品檢驗中如何準確定量蛋白含量，特別是多種蛋白混合后如何鑒別各自的蛋白。
[0005]目前，常用的蛋白定量方法有BCA法、Bradford法或Lowry法，但僅用于蛋白定量，均不能區分多種蛋白混合后不同蛋白的含量。
[0006]因此，亟需一種定量檢測口蹄疫O型病毒蛋白含量的方法，其不僅能檢測口蹄疫O型病毒蛋白含量，也能從多種蛋白混合物中檢測口蹄疫O型病毒蛋白含量；還需要對半成品疫苗和成品疫苗中抗原含量同時進行檢測，以滿足產品質量檢測的需要。

技術實現思路

[0007]基于單克隆抗體技術建立的雙抗體夾心ELISA方法可以特異性的檢測不同的蛋白，且能準確有效的定量蛋白含量，為病毒亞單位疫苗的研發提供支持。為解決現有技術的不足，本專利技術提供了一對能特異性結合O型口蹄疫病毒的單克隆抗體，以及含單克隆抗體對的雙抗體夾心檢測試劑盒及其應用。
[0008]本專利技術涉及特異性結合SEA型O型口蹄疫病毒樣顆粒的單克隆抗體。
[0009]本專利技術還涉及高靈敏度、良好特異性、重復性良好地檢測SEA型O型口蹄疫病毒樣顆粒的試劑盒。
[0010]本專利技術還涉及長保存期的SEA型O型口蹄疫病毒樣顆粒的檢測試劑盒。
[0011]本專利技術還涉及能與SEA型O型口蹄疫病毒樣顆粒具有良好反應特性的單鏈抗體。
[0012]本專利技術涉及能檢測口蹄疫O型病毒蛋白含量的試劑盒。
[0013]本專利技術涉及能從多種蛋白混合物中檢測口蹄疫O型病毒蛋白含量的試劑盒。
[0014]本專利技術涉及能檢測疫苗半成品和疫苗成品中口蹄疫O型病毒蛋白含量的試劑盒。
附圖說明
[0015]圖1為本專利技術試劑盒檢測SEA型O型病毒樣顆粒標準品的標準曲線，顯示標準品在3.9μg/ml～500μg/ml范圍內，線性關系良好，R2＞0.99；檢測靈敏度為3.9μg/ml。
具體實施方式
[0016]定義
[0017]“口蹄疫病毒”屬于小RNA病毒科，口瘡病毒屬，該病毒有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非口蹄疫病毒1、2、3型)和Asia1(亞洲1型)7個血清型，各型之間無交叉保護反應，每個類型內又有多個亞型。在病毒的中心為一條單鏈的正鏈RNA，由大約8000個堿基組成，是感染和遺傳的基礎；周圍包裹著的蛋白質決定了病毒的抗原性、免疫性和血清學反應能力；病毒外殼為對稱的20面體?？谔阋卟《臼桥继泐悇游锔叨葌魅拘约膊　谔阋叩牟≡?，國際獸疫局將口蹄疫列為“A類動物傳染病名單”中的首位，中國把它列為“進境動物檢疫一類傳染病”，我國對口蹄疫的防治，預防主要通過疫苗注射接種，發生口蹄疫的動物則捕殺。
[0018]術語“病毒樣顆粒(virus
?
like particles，VLPs)”是由一種或多種病毒結構蛋白組裝成的顆粒，具有與病毒顆粒相似的外部結構和抗原性，但不含病毒基因。
[0019]術語“SEA型O型口蹄疫病毒樣顆粒”是以O型口蹄疫病毒SEA型基因序列編碼的結構蛋白組裝成的病毒樣顆粒，具體制備可參見中國專利CN111840533A，但不限于此。
[0020]術語“單克隆抗體”是指由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，獲自基本上同源的抗體群的抗體，即組成該群體的抗體個體都相同，除了可能存在少量可能的自發突變。因此，修飾語“單克隆”是指該抗體的性質不是離散抗體的混合物。優選地，所述單克隆抗體包括單價的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結合結構域的任何多肽?？贵w為涵蓋具有所需特異性的結合結構域的任意特異性結合因子，因而，這個術語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、人源化抗體以及抗體的功能等同物和同源物，也包括含有抗原結合結構域的任何多肽，無論是天然的還是合成產生的。抗體的實例是免疫球蛋白亞型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亞型亞類；也可以是包含抗原結合結構域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和雙鏈抗體(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原結合結構域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述?？贵w可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術來產生保留原來抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這種技術可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區或互補性決定區(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區或恒定區加框架區，參見EP.A.184187、GB2188638A或EP.A.239400。還可以對雜交瘤細胞或產生抗體的其它細胞進行遺傳突變或其它改變，這可以改變或者不改變所產生抗體的結合特異性。用于本專利技術的
“
單克隆抗體”也可用雜交瘤方法制得，因為編碼本專利技術鼠源化抗體的DNA序列可用本領域技術人員熟知的常規手段，如根據本專利技術公開的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用PCR法擴增得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領域熟知的各種方法將該序列連入合適的表達載體中。最后，在適合本專利技術抗體表達的條件下，培養轉化所得的宿主細胞，然后本領域技術人員應用熟知的常規分離純化手段純化得到本專利技術的單克隆抗體?？贵w包含通過二硫橋連接在一起的多肽鏈幾何體，稱為輕鏈和重鏈的兩條多肽主鏈構成抗體的所有主要結構類別(同型物)。重鏈和輕鏈都進一步可分為稱作可變區和恒定區本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種特異性結合SEA型O型口蹄疫病毒的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段的重鏈可變區為SEQ.ID No.1或其簡并序列所編碼，所述抗體或抗體片段的輕鏈可變區為SEQ.ID No.2或其簡并序列所編碼；所述抗體為單克隆抗體、基因工程抗體；其中，所述基因工程抗體包括單鏈抗體、嵌合單克隆抗體、改形單克隆抗體；所述抗體或所述抗體片段特異性結合SEA型O型口蹄疫病毒樣顆粒。2.根據權利要求1所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體為單克隆抗體4E3，所述單克隆抗體4E3的重鏈可變區為SEQ.ID No.1或其簡并序列所編碼，其輕鏈可變區為SEQ.ID No.2或其簡并序列所示編碼。3.雜交瘤細胞4E3株，其分泌權利要求2所述的單克隆抗體4E3。4.一種特異性結合SEA型O型口蹄疫病毒的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段的重鏈可變區為SEQ.ID No.3或其簡并序列所編碼，所述抗體或抗體片段的輕鏈可變區為SEQ.ID No.4或其簡并序列所編碼；所述抗體為單克隆抗體、基因工程抗體；其中，所述基因工程抗體包括單鏈抗體、嵌合單克隆抗體、改形單克隆抗體；所述抗體或所述抗體片段特異性結合SEA型O型口蹄疫病毒樣顆粒。5.根據權利要求4所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體為單克隆抗體4D5，其中，所述單克隆抗體4D5的重鏈可變區為SEQ.ID No.3或其簡并序列所編碼，其輕鏈可變區為SEQ.ID No.4或其簡并序列所編碼。6.雜交瘤細胞4D5株，其分泌權利要求5所述的單克隆抗體4D5。7.一種檢測SEA型O型口蹄疫病毒抗原的試劑盒，其中，所述試劑盒包括：包被了權利要求2所述的單克隆抗體4E3的支持介質，所述支持介質在包被了所述單克隆抗體4E3后用封閉液封閉，酶標記的權利要求5所述的單克隆抗體4D5；或包被了所述的單克隆抗體4D5的支持介質，所述支持介質在包被了所述單克隆抗體4D5后用封閉液封閉，酶標記的單克隆抗體4E3；或包被了單克隆抗體2A7的支持介質，所述支持介質在包被了所述單克隆抗體2A7后用封閉液封閉，酶標記的單克隆抗體4E3；或包被了單克隆抗體2A7的支持介質，所述支持介質在包被了所述單克隆抗體2A7后用封閉液封閉，酶標記的所述的單克隆抗體4D5；20
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濃縮洗滌液，所述20
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濃縮洗滌液為含10％v/v的吐溫20 的pH 7.4的0.1M PBS溶液；標準品，所述標準品為SEA型O型口蹄疫病毒樣顆粒；顯色液，所述顯色液包括顯色液A、顯色液B，顯...

【專利技術屬性】
技術研發人員：田克恭，燕賀，張云靜，肖燕，鄧均華，
申請(專利權)人：洛陽普泰生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：