一種基于IP-10抗原表位肽-載體蛋白抗原的IP-10體外診斷試劑盒制備方法技術

本發明專利技術提供一種基于IP

【技術實現步驟摘要】
一種基于IP
?
10抗原表位肽
?
載體蛋白抗原的IP
?
10體外診斷試劑盒制備方法


[0001]本專利技術屬于免疫學
，更具體地說，涉及一種基于IP
?
10抗原表位肽
?
載體蛋白抗原的IP
?
10體外診斷試劑盒制備方法。

技術介紹

[0002]干擾素γ誘導蛋白
?
10(Interferon
?
gamma inducible、protein，IP
?
10)也稱為CXC趨化因子10(CXCL10)，屬于非谷氨酸
?
亮氨酸
?
精氨酸CXC類趨化因子家族成員之一。
[0003]IP
?
10基因定位于染色體4q21，含有3個內含子和4個外顯子，成熟IP
?
10含有77個氨基酸殘基，分質量為10kD，其一級氨基酸序列中含有4個保守半胱氨酸殘基，形成2個內部二硫鍵的蛋白。IP
?
10主要來源為成纖維細胞、單核細胞、巨噬細胞及T淋巴細。IP
?
10結合受體為CXCR3，存在T淋巴細胞(Th1)、天然殺傷癥(NK)細胞和嗜酸性細胞表面，與其他化學趨化因子不同，IP
?
10對嗜中性粒細胞沒有趨化活性，可激活T細胞和單核細胞，還可刺激NK細胞和T細胞遷移，調節T細胞成熟和粘附分子表達，也可抑制骨髓群的形成和血管生成作用。
[0004]研究發現，病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染人體后，引發機體內IP
?
10水平升高。有研究檢測新生兒血清中IP
?
10水平，發現在1小時內，新生兒感染組血清中IP
?
10水平明顯高于未感染組，在24小時內，血清中IP
?
10水平達高峰。當血清中IP
?
10濃度>1250pg/mL，診斷新生兒敗血癥，其靈敏度為93％，特異性為89％。可見，檢測血液中的IP
?
10水平，可用于早期診斷感染性疾病的發生，需要開發簡單，快速及定量檢測IP
?
10試劑盒。

技術實現思路

[0005]本專利技術的目的是為了解決現有技術中存在的缺點，而提出的一種基于IP
?
10抗原表位肽
?
載體蛋白抗原的IP
?
10體外診斷試劑盒制備方法，本專利技術制備IP
?
10抗體并建立檢測IP
?
10免疫層析試劑盒，特異，快速及定量檢測血液或其他體液中IP
?
10濃度，用于診斷感染性疾病或敗血癥的發生。
[0006]為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：
[0007]一種基于IP
?
10抗原表位肽
?
載體蛋白抗原的IP
?
10體外診斷試劑盒制備方法，包括如下步驟：
[0008]S1、合成IP
?
10肽，所述合成IP
?
10肽的具體步驟包括：
[0009]A、合成IP
?
10抗原表位肽；
[0010]B、合成IP
?
10校準品肽；
[0011]C、合成IP
?
10連接肽；
[0012]S2、制備IP
?
10
?
N抗體，所述制備IP
?
10
?
N抗體的具體步驟包括：
[0013]H、IP
?
10
?
N抗原表位肽偶聯載體蛋白；
[0014]I、制備IP
?
10
?
N
?
KLH抗原；
[0015]J、IP
?
10
?
N抗原免疫動物；
[0016]K、檢測IP
?
10
?
N抗血清滴度；
[0017]L、制備IP
?
10
?
親合層析瓊脂糖；
[0018]M、純化IP
?
10
?
N抗體；
[0019]N、測定IP
?
10
?
N抗體親和力及特異性；
[0020]S3、制備IP
?
10
?
C抗體；
[0021]S4、制備檢測IP
?
10熒光免疫層析試劑盒：
[0022]D、IP
?
10
?
C抗體偶聯熒光微球；
[0023]E、噴涂Fusion5和硝酸纖維素膜；
[0024]F、制備免疫層析檢測卡。
[0025]其中，所述IP
?
10
?
N抗原表位肽偶聯載體蛋白，包括以下步驟：
[0026](1).KLH載體蛋白液：5mg Maleimide活化KLH載體(ActiveHOOK KLH)，溶解在1.0ml ddH2O中；
[0027](2).IP
?
10
?
N抗原表位肽液:5mg合成IP
?
10
?
N抗原表位肽，純度>90％，溶解在1.0mlPBSPH7.4；
[0028](3).KLH載體蛋白液與IP
?
10
?
N抗原表位肽液混合，室溫，搖動2小時；
[0029](4).將上述反應液放入MWCO 12K蛋白透析膜袋中，用PBSPH7.4透析，2
?
8℃，過夜；
[0030](5).獲得上述含IP
?
10
?
N
?
KLH透析液，測定IP
?
10
?
N
?
KLH濃度，
?
80℃凍存；
[0031]其中，制備所述IP
?
10
?
N
?
KLH抗原時，PBSPH7.4調節IP
?
10
?
N
?
KLH抗原濃度到1.0mg/ml，用0.22um微孔濾膜，過濾除菌，IP
?
10
?
N
?
KLH抗原與福氏完全佐劑(1：1)混合，形成抗原A；IP
?
10
?
N
?
KLH抗原與福氏不完全佐劑(1：1)混合，形成抗原B。
[0032]其中，所述IP
?
10
?
N抗原免疫動物，包括以下步驟：
[0033]選用6
?
10月的Boer本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種基于IP
?
10抗原表位肽
?
載體蛋白抗原的IP
?
10體外診斷試劑盒制備方法，其特征在于，包括如下步驟：S1、合成IP
?
10肽，所述合成IP
?
10肽的具體步驟包括：A、合成IP
?
10抗原表位肽；B、合成IP
?
10校準品肽；C、合成IP
?
10連接肽；S2、制備IP
?
10
?
N抗體，所述制備IP
?
10
?
N抗體的具體步驟包括：A、IP
?
10
?
N抗原表位肽偶聯載體蛋白；B、制備IP
?
10
?
N
?
KLH抗原；C、IP
?
10
?
N抗原免疫動物；D、檢測IP
?
10
?
N抗血清滴度；E、制備IP
?
10
?
親合層析瓊脂糖；F、純化IP
?
10
?
N抗體；G、測定IP
?
10
?
N抗體親和力及特異性；S3、制備IP
?
10
?
C抗體；S4、制備檢測IP
?
10熒光免疫層析試劑盒：A、IP
?
10
?
C抗體偶聯熒光微球；B、噴涂Fusion5和硝酸纖維素膜；C、制備免疫層析檢測卡。2.根據權利要求1所述的一種基于IP
?
10抗原表位肽
?
載體蛋白抗原的IP
?
10體外診斷試劑盒制備方法，其特征在于：所述IP
?
10
?
N抗原表位肽偶聯載體蛋白，包括以下步驟：(1).KLH載體蛋白液：5mg Maleimide活化KLH載體(ActiveHOOK KLH)，溶解在1.0ml ddH2O中；(2).IP
?
10
?
N抗原表位肽液:5mg合成IP
?
10
?
N抗原表位肽，純度>90％，溶解在1.0mlPBSPH7.4；(3).KLH載體蛋白液與IP
?
10
?
N抗原表位肽液混合，室溫，搖動2小時；(4).將上述反應液放入MWCO 12K蛋白透析膜袋中，用PBSPH7.4透析，2
?
8℃，過夜；(5).獲得上述含IP
?
10
?
N
?
KLH透析液，測定IP
?
10
?
N
?
KLH濃度，
?
80℃凍存。3.根據權利要求1所述的一種基于IP
?
10抗原表位肽
?
載體蛋白抗原的IP
?
10體外診斷試劑盒制備方法，其特征在于：制備所述IP
?
10
?
N
?
KLH抗原時，PBSPH7.4調節IP
?
10
?
N
?
KLH抗原濃度到1.0mg/ml，用0.22um微孔濾膜，過濾除菌，IP
?
10
?
N
?
KLH抗原與福氏完全佐劑(1：1)混合，形成抗原A；IP
?
10
?
N
?
KLH抗原與福氏不完全佐劑(1：1)混合，形成抗原B。4.根據權利要求1所述的一種基于IP
?
10抗原表位肽
?
載體蛋白抗原的IP
?
10體外診斷試劑盒制備方法，其特征在于：所述IP
?
10
?
N抗原免疫動物，包括以下步驟：選用6
?
10月的Boer公山羊：Day 1:1.6ml抗原A，注射到山羊皮下，40點注射(40ul/每點)；Day 14：0.8抗原B，注射到山羊皮下，20點注射(40ul/每點)；Day 28：加強注射抗原B一次；Day 42：加強注射抗原B一次；
Day 49：采集山羊血液200ml，測定IP
?
10
?
N抗血清滴度；Day 56：加強注射抗原B一次；Day 63：采集山羊血液，終止實驗。5.根據權利要求1所述的一種基于IP
?
10抗原表位肽
?
載體蛋白抗原的IP
?
10體外診斷試劑盒制備方法，其特征在于：所述檢測IP
?
10
?
N抗血清滴度，步驟如下：用50mM PH9.6碳酸鹽緩沖液制備10ug/mlIP
?
10校準品肽包被液，10ug/mlBSA包被液，加100ul包被液到酶聯反應板孔中，2
?
8℃，過夜去；去除包被液，加100ul封閉液，PBSPH7.4，1.0％BSA到酶聯反應板孔中，室溫，4小時，去除封閉液；用PBS
?
T，含0.05％Tween20洗滌2次；制備0，10，100，1000倍稀釋IP
?
10
?
N抗血清，100ul稀釋抗血清加到酶聯反應板孔中，室溫，反應1小時，去除反應液，用PBS
?
T洗滌5次；1：4000抗羊IgG抗體
?

【專利技術屬性】
技術研發人員：王曉慧，孫彧峰，關恒，張金玲，丁書博，林琳，牛公正，
申請(專利權)人：長春恒曉生物科技有限責任公司，
類型：發明
國別省市：