分離純化GluN2B蛋白用纖維膜、制備方法及應用技術

本發明專利技術屬于生物醫學工程領域，公開了一種分離純化GluN2B蛋白用纖維膜、制備方法及應用。纖維膜由磷酸化的CaMKII蛋白通過磷酯鍵與PVA固體載體鍵合得到。制備方法包括：將PVA和CaMKII蛋白用三氯氧磷交聯，制備PVA

【技術實現步驟摘要】
分離純化GluN2B蛋白用纖維膜、制備方法及應用


[0001]本專利技術涉及生物醫學工程領域，具體涉及一種分離純化GluN2B蛋白用纖維膜、制備方法及應用。

技術介紹

[0002]NMDAR受體，是一種離子型谷氨酸受體，其與突觸的可塑性和學習記憶密切相關。通過該受體本身、其共軛的離子通道及調節部位3者形成的復合體而發揮功能，對Ca
2+
高度通透。每個NMDAR受體上含有兩個谷氨酸和兩個甘氨酸結合識別位點，谷氨酸和甘氨酸均是受體的特異性激活劑。它是中樞神經系統內一類重要的興奮性氨基酸受體。NMDAR受體不僅在神經系統發育過程中發揮著重要的生理作用，如可調節神經元的存活，調節神經元樹突、軸突結構發育及參與突觸可塑性的形成等；在神經元回路的形成中NMDAR受體亦起著關鍵作用，有資料表明NMDAR受體是學習與記憶過程中一類至關重要的受體。
[0003]突觸部位存在GluN2B的NMDA受體能保持活性連續的細胞交流，大量動物實驗證據暗示存在GluN2B的NMDA受體誘導興奮性毒性細胞死亡和β淀粉樣蛋白(Aβ)突觸功能障礙。因此，抑制GluN2B
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NMDA受體被認為是阿茲海默癥提供神經保護和改善認知功能的一個潛在治療策略。GluN2B蛋白被神經科學廣泛關注。但是在神經科學研究過程中，分離純化GluN2B蛋白難度較大。目前還沒有簡易可操作的標準化試劑盒及方法用于獲得GluN2B蛋白。

技術實現思路

[0004]有鑒于此，本專利技術的目的在于提供一種分離純化GluN2B蛋白用纖維膜、制備方法及應用，該纖維膜制備方法簡單，能夠高效富集并純化GluN2B蛋白。
[0005]為了解決上述技術問題，本專利技術提供了以下技術方案：
[0006]一種分離純化GluN2B蛋白用纖維膜，所述分離純化GluN2B蛋白用纖維膜為PVA
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P
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CaMKII納米纖維膜，所述PVA
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P
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CaMKII納米纖維膜由磷酸化的CaMKII蛋白通過磷酯鍵與PVA固體載體鍵合得到。
[0007]本專利技術還提供了一種上述分離純化GluN2B蛋白用纖維膜的制備方法，包括如下步驟：
[0008]S1.將PVA(聚乙烯醇)和CaMKII蛋白(鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II)混合凍干后研磨至5nm粉末，在氮氣氛圍下逐滴加入POCl3、吡啶與氯仿的混合制劑，0
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4℃反應20
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30min，之后升溫至10
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15℃，繼續反應20
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30min，最后升溫至18
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20℃，繼續反應20
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30min，加入丙酮洗滌3遍之后用氮氣流吹干，得到PVA
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P
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CaMKII復合物；
[0009]S2.將所述PVA
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P
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CaMKII復合物溶于水，制得紡絲液，進行靜電紡絲，得到纖維膜，將所述纖維膜用鹽酸與戊二醛熏蒸交聯得到PVA
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P
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CaMKII納米纖維膜。
[0010]進一步的，上述制備方法的步驟S1中，PVA、CaMKII蛋白、POCl3、吡啶與氯仿的用量比例為(1
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3)g:(20
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45)mg:(10
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15)mL:(250
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320)μL:(10
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15)mL。
[0011]進一步的，上述制備方法的步驟S2中，所述紡絲液中，PVA
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P
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CaMKII復合物的質量百分比濃度為8
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10％。
[0012]進一步的，上述制備方法的步驟S2中，所述靜電紡絲條件為：電壓15
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20KV，距離10
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15cm，進樣速率0.3
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0.7mL/h，溫度25
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35℃，收集板為硅油紙。
[0013]進一步的，上述制備方法的步驟S2中，所述熏蒸交聯操作中，鹽酸的用量為每dm2的纖維膜10
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15mL，戊二醛用量為每dm2的纖維膜5
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8mL。
[0014]本專利技術還提供了上述的分離純化GluN2B蛋白用纖維膜在分離純化GluN2B蛋白中的應用。
[0015]進一步的，上述應用中，所述分離純化GluN2B蛋白具體為：將PVA
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P
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CaMKII納米纖維膜浸漬于含Ca
2+
的神經組織膜蛋白提取液中4℃振蕩吸附20min，用PBS洗滌2次；再用含有EGTA的PBS緩沖液洗脫，經超濾離心管離心，PBS洗滌除去EGTA后，收集得到GluN2B蛋白。
[0016]進一步的，上述應用中，所述含Ca
2+
的神經組織膜蛋白提取液為含CaCl2的神經組織膜蛋白提取液，其中，CaCl2的濃度為2.0
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2.5mmol/L。
[0017]進一步的，上述應用中，所述含有EGTA的PBS緩沖液中，EGTA的濃度為2.5
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3.0mmol/L。
[0018]與現有技術相比，本專利技術具有以下有益效果：
[0019]本申請通過采用PVA作為載體，將生物大分子CaMKII蛋白通過磷酯鍵鍵合到高生物親和性大分子PVA上，制備PVA
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P
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CaMKII納米纖維膜，實現了將生物大分子CaMKII蛋白固定到PVA載體上的同時實現了CaMKII蛋白的磷酸化，即激活了生物大分子CaMKII蛋白，在Ca
2+
存在時可以特異性結合GluN2B蛋白。利用本專利技術制備得到的納米纖維膜進行常規的層析方法，通過EGTA螯合關鍵離子，解離洗脫目標蛋白，獲得蛋白凝析縮合物，分離純化微量蛋白。操作簡易，速度快捷。
具體實施方式
[0020]根據下述實施例，可以更好地理解本專利技術。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本專利技術，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本專利技術。
[0021]實施例1
[0022]1、將2g PVA和32mg CaMKII蛋白混合凍干后研磨至5nm粉末，在氮氣氛圍下逐滴加入12mL POCl3、285μL吡啶與12mL氯仿的混合制劑，2℃反應28min，之后升溫至12℃，繼續反應25min，最后升溫至19℃，繼續反應25min，加入丙酮洗滌3遍之后用氮氣流吹干，得到PVA
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P
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CaMKII復合物；
[0023]2、取0.9g步驟1制得的PVA
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CaMKII復合物溶于9.1mL水，制得紡絲液，進行靜電紡絲，電壓17KV，距離12cm，進樣速率0.5mL/h，溫度30本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種分離純化GluN2B蛋白用纖維膜，其特征在于，所述分離純化GluN2B蛋白用纖維膜為PVA
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CaMKII納米纖維膜，所述PVA
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CaMKII納米纖維膜由磷酸化的CaMKII蛋白通過磷酯鍵與PVA固體載體鍵合得到。2.一種權利要求1所述的分離純化GluN2B蛋白用纖維膜的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：S1.將PVA和CaMKII蛋白混合凍干后研磨至5nm粉末，在氮氣氛圍下逐滴加入POCl3、吡啶與氯仿的混合制劑，0
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4℃反應20
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30min，之后升溫至10
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15℃，繼續反應20
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30min，最后升溫至18
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20℃，繼續反應20
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30min，加入丙酮洗滌3遍之后用氮氣流吹干，得到PVA
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CaMKII復合物；S2.將所述PVA
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CaMKII復合物溶于水，制得紡絲液，進行靜電紡絲，得到纖維膜，將所述纖維膜用鹽酸與戊二醛熏蒸交聯得到PVA
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CaMKII納米纖維膜。3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟S1中，PVA、CaMKII蛋白、POCl3、吡啶與氯仿的用量比例為(1
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3)g:(20
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45)mg:(10
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15)mL:(250
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320)μL:(10
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15)...

【專利技術屬性】
技術研發人員：湯佳鵬，鞠雨晴，姜輝，朱俐，
申請(專利權)人：南通大學，
類型：發明
國別省市：