本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種阻斷異嗜性人IgM反應(yīng)性的單克隆抗體VH的CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:1?3所示的氨基酸序列，VL的CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:5?7所示的氨基酸序列。并公開了其制備方法。本發(fā)明專利技術(shù)通過噬菌體展示的方法篩選出一種全新的高效封閉異嗜性人IgM反應(yīng)性的抗體。一方面得到的抗體序列可讀，可以通過親和力成熟的方法再次提高結(jié)合力和穩(wěn)定性，另一方面利用CHO細(xì)胞高密度懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)重組抗體產(chǎn)量高、成本低、批間差小、尤其是與以往的封閉劑都需要使用大量小鼠生產(chǎn)腹水進(jìn)行生產(chǎn)相比具有明顯的動物福利優(yōu)勢。并且為后期開發(fā)復(fù)合Fc亞型的主被動混合型的高效封閉異嗜性人IgM反應(yīng)性的抗體提供了序列基礎(chǔ)。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
阻斷異嗜性人IgM反應(yīng)性的單克隆抗體及其制備方法
本專利技術(shù)涉及一種阻斷異嗜性人IgM反應(yīng)性的單克隆抗體及其制備方法，屬于醫(yī)學(xué)免疫領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
異嗜性抗體(HA)是由已知的或未知的抗原物質(zhì)刺激人體產(chǎn)生的一類具有足夠滴度、能與多個物種的免疫球蛋白發(fā)生相對弱的結(jié)合的多重特異性的免疫球蛋白。異嗜性抗體的產(chǎn)生通常是由于人類直接接觸到動物、污染的食品、未經(jīng)高溫消毒的鮮奶和免疫療法或者接種來源于動物血清或組織的疫苗產(chǎn)品后產(chǎn)生。據(jù)研究證實，在健康人群中，約3％～15％體內(nèi)含異嗜性抗體，這些異嗜性抗體經(jīng)常引起測值的假陽性，嚴(yán)重干擾免疫檢測試劑的結(jié)果。常見的異嗜性抗體有人自身類風(fēng)濕因子(RF)和人抗小鼠抗體(HAMA)等。人自身類風(fēng)濕因子(RF)可以與人自身的免疫球蛋白(IG)結(jié)合，同時也可以與動物免疫球蛋白交叉反應(yīng)，從而引起RF干擾。RF因子分為IgM、IgA、IgG、IgD、IgE五型，其中70～80％為IgM型。人抗小鼠抗體(HAMA)可以特異性的結(jié)合小鼠抗體。目前免疫診斷試劑中的單克隆抗體基本都是小鼠來源，所以HAMA引起的干擾非常普遍。HAMA抗體中IgM型是五聚體十價抗體，能夠形成大量非特異性的捕獲抗體-HAMA-標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物，嚴(yán)重影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此如何有效阻斷異嗜性人IgM反應(yīng)性是各類免疫類抗原檢測系統(tǒng)所必須解決的問題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種阻斷異嗜性人IgM反應(yīng)性的單克隆抗體，該抗體可以有效阻斷異嗜性抗體的干擾，可用于膠乳比濁等體外診斷方法，提高檢測準(zhǔn)確性。為達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案為：一種阻斷異嗜性人IgM反應(yīng)性的單克隆抗體，其特征在于：VH的CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQIDNO:1-3所示的氨基酸序列，VL的CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQIDNO:5-7所示的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述VH具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，所述VL具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。本專利技術(shù)還提供了上述的阻斷異嗜性人IgM反應(yīng)性的單克隆抗體的制備方法，其步驟包括：(1)表達(dá)人IgMCH1抗原：構(gòu)建表達(dá)人IgMCH1抗原的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到大腸桿菌菌株中，選擇陽性克隆，大量表達(dá)后回收菌體，超聲裂解后通過鎳柱純化出Histag-人IgMCH1抗原；(2)免疫小鼠：取小鼠，先免疫Histag-人IgMCH1抗原，再免疫天然人IgM，取全血并取脾臟；(3)構(gòu)建抗人IgMCH1的噬菌體抗體展示庫：提取小鼠脾臟RNA，并用IgG恒定區(qū)C末端部分的反向特異性引物合成抗體cDNA庫，以小鼠抗體重鏈可變區(qū)N末端正向引物和重鏈可變區(qū)C末端反向引物PCR擴(kuò)增小鼠抗體VH部分基因、以小鼠抗體輕鏈可變區(qū)N末端正向引物和可變區(qū)C末端反向引物PCR擴(kuò)增小鼠抗體VL部分基因、并通過預(yù)先設(shè)計的引物接頭部分序列將VH和VL重疊延伸擴(kuò)增出VH-linker-VL基因，以SfiI和NotI酶切VH-linker-VL片段并純化，將該片段連接到預(yù)先準(zhǔn)備好的噬菌體展示載體；(4)篩選與IgM特異性反應(yīng)的噬菌體抗體：人IgM包被到免疫管后封閉，封閉后的噬菌體與免疫管反應(yīng)，使抗原特異性噬菌體與包被在免疫管壁上的人IgM充分結(jié)合，洗脫特異性結(jié)合的噬菌體，感染生長期的大腸桿菌細(xì)胞，篩選重復(fù)多次，濃縮得到特異性抗人IgM噬菌體抗體庫；(5)篩選特異性阻斷IgM反應(yīng)性的單克隆抗體：從噬菌體抗體庫中挑取多個單克隆菌落，ELISA確認(rèn)每個克隆對IgM的反應(yīng)性，對與IgM特異性反應(yīng)的克隆進(jìn)行測序，確認(rèn)抗體的種類，對得到的抗體，以將過量噬菌體抗體添加到樣品稀釋緩沖液的方法，進(jìn)行RF陽性樣品阻斷實驗，最終得到高效阻斷IgM反應(yīng)性的單克隆抗體。本專利技術(shù)通過噬菌體展示的方法篩選出一種全新的高效封閉異嗜性人IgM反應(yīng)性的抗體。一方面得到的抗體序列可讀，可以通過親和力成熟的方法再次提高結(jié)合力和穩(wěn)定性，另一方面利用CHO細(xì)胞高密度懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)重組抗體產(chǎn)量高、成本低、批間差小、尤其是與以往的封閉劑都需要使用大量小鼠生產(chǎn)腹水進(jìn)行生產(chǎn)相比具有明顯的動物福利優(yōu)勢。并且為后期開發(fā)復(fù)合Fc亞型的主被動混合型的高效封閉異嗜性人IgM反應(yīng)性的抗體提供了序列基礎(chǔ)。附圖說明圖1為人IgMCH1抗原表達(dá)載體示意圖。圖2為純化后的Histag-人IgMCH1抗原SDS-PAGE結(jié)果。圖3:噬菌體展示載體示意圖圖4:3次篩選富集后噬菌體抗體的ELISA結(jié)果。圖5:阻斷RF陽性樣品實驗結(jié)果。具體實施方式步驟1:表達(dá)人IgMCH1抗原設(shè)計引物PCR擴(kuò)增人IgM恒定區(qū)(CH1區(qū))序列，在引物兩端加上NdeI和XhoI酶切位點。正向引物pF：GGAATTCCATATGGGGAGTGCATCCGCCCCAACC反向引物pR：TGTCAACTCGAGCTATTACACTGGAAGAGGCACGTTCTTTTC根據(jù)NCBIGeneID:3507的序列，人工合成的人IgM恒定區(qū)序列作為模板，通過PCR擴(kuò)增目的片段，并通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)片段大小與預(yù)期一致，進(jìn)一步切膠純化目的片段。用NdeI和XhoI酶切目的片段，并純化酶切產(chǎn)物。用T4連接酶將酶切純化后的目的片段連接到已用NdeI和XhoI酶切處理過的pET28a載體，并轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。將測序正確的質(zhì)粒(圖1)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株，挑取兩個克隆加IPTG少量誘導(dǎo)表達(dá)，并通過SDS-PAGE確認(rèn)有目的蛋白表達(dá)。下一步取其中一個克隆作為工作菌種，IPTG濃度0.5mM，30度6小時，進(jìn)行1L體系的大量表達(dá)。回收全部菌體，超聲裂解后通過鎳柱純化出Histag-人IgMCH1抗原。用SDS-PAGE確認(rèn)目的蛋白純度(圖2)。步驟2:免疫小鼠選8只4-6周齡雌性BALB/c小鼠，共免疫5次。第一次免疫20ug/只His-hIgMCH1；第二次免疫20ug/只His-hIgMCH1；第三次免疫20ug/只His-hIgMCH1；第四次免疫20ug/只天然人IgM；第五次免疫20ug/只天然人IgM。免疫結(jié)束，取全血并摘取脾臟液氮速凍保存。步驟3:構(gòu)建抗人IgMCH1的噬菌體抗體展示庫Trizol法提取小鼠脾臟RNA，并用IgG恒定區(qū)C末端部分的反向特異性引物合成抗體cDNA庫，引物序列為：[mJH1]TGAGGARACGGTGACCG[mJH2]TGAGGAGACTGTGAGAGWGG[mCKR]ACACTCATTCCTGTTGAAGC。以小鼠抗體重鏈可變區(qū)N末端(V區(qū))正向引物和重鏈可變區(qū)C末端(J區(qū))反向引物PCR擴(kuò)增小鼠抗體重鏈可變區(qū)(VH)部分基因、以小鼠抗體輕鏈可變區(qū)N末端(V區(qū))正向引物和可變區(qū)C末端(J區(qū))反向引物PCR擴(kuò)增小鼠抗體輕鏈可變區(qū)(VL)部分基因、并通過預(yù)先設(shè)計的引物接頭部分序列將V本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種阻斷異嗜性人IgM反應(yīng)性的單克隆抗體，其特征在于：VH的CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列，VL的CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:5-7所示的氨基酸序列。/n
【技術(shù)特征摘要】
1.一種阻斷異嗜性人IgM反應(yīng)性的單克隆抗體，其特征在于：VH的CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQIDNO:1-3所示的氨基酸序列，VL的CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQIDNO:5-7所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的阻斷異嗜性人IgM反應(yīng)性的單克隆抗體，其特征在于：所述VH具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，所述VL具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的阻斷異嗜性人IgM反應(yīng)性的單克隆抗體的制備方法，其步驟包括：
(1)表達(dá)人IgMCH1抗原：構(gòu)建表達(dá)人IgMCH1抗原的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到大腸桿菌菌株中，選擇陽性克隆，大量表達(dá)后回收菌體，超聲裂解后通過鎳柱純化出Histag-人IgMCH1抗原；
(2)免疫小鼠：取小鼠，先免疫Histag-人IgMCH1抗原，再免疫天然人IgM，取全血并取脾臟；
(3)構(gòu)建抗人IgMCH1的噬菌體抗體展示庫：提取小鼠脾臟RNA，并用IgG恒定區(qū)C末端部分的反向特異性引物合成抗體cDN...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李哲，劉宏偉，周淼，
申請(專利權(quán))人：捷和泰北京生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：北京;11
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