一種基于納米磁顆粒數量和狀態變化的磁弛豫時間傳感器檢測農藥殘留的方法技術

本發明專利技術公開了一種基于生物正交反應改變納米磁顆粒數量及狀態，進而檢測農藥殘留的生物傳感方法，該方法基于二苯基環辛炔與疊氮的級聯生物正交反應同時改變納米磁顆粒的數量和聚集狀態，實現了磁納米顆粒數量和狀態的可控調節，二者有機結合進行磁信號級聯放大，從而提高農藥殘留檢測的準確性和靈敏度。

A method of detecting pesticide residues by magnetic relaxation time sensor based on the change of the number and state of nanoparticles

【技術實現步驟摘要】
一種基于納米磁顆粒數量和狀態變化的磁弛豫時間傳感器檢測農藥殘留的方法
本專利技術屬于食品安全檢測
，具體涉及一種基于納米磁顆粒數量和狀態變化的磁弛豫時間傳感器檢測農藥殘留的方法。
技術介紹
食品安全關系廣大人民群眾身體健康，是一項重要的民生工程，而食品中農藥殘留是危害人類健康的一個重要的食品安全問題。由于違規使用高毒農藥、病蟲抗藥性增強、農藥使用不當等原因常常造成農藥殘留超標，而農藥殘留對人體健康危害巨大，會造成急性中毒或慢性中毒，降低人體免疫力、可致癌、致畸和致突變，甚至造成個體死亡。鑒于農藥殘留給健康帶來的巨大危害，減少、合理使用農藥是解決問題的根本措施，而食品中農藥殘留的快速、準確檢測則是保證合理使用的前提和保障人民群眾舌尖上安全的最后一道防線。目前，對食品中農藥殘留定性定量分析的主要手段是儀器分析法、酶抑制法和免疫分析法。儀器分析方法具有靈敏度高、準確性好等優勢，但樣品前處理復雜，檢測成本高，需要較高水平的專業技術人員，不適合現場快速檢測。酶抑制法主要針對有機磷農藥，具有操作簡單、成本低等優勢，但其容易受樣品基質的干擾，假陽性比較多，準確性不夠。傳統免疫分析主要包括酶聯免疫吸附測定法(ELISA)和膠體金免疫層析試紙條方法。ELISA具有操作相對簡單、高通量等優勢，但是，某些農藥殘留的濃度可能非常低，傳統的ELISA方法無法滿足檢測需求。膠體金免疫層析試紙條方法具有操作簡單、檢測速度快等優勢，但其靈敏度低，容易受到基質干擾等。因此傳統的免疫測定法無法滿足檢測靈敏度的實際需求。篩選具有較高親和力結合的抗體可以提高的靈敏度，但往往較為昂貴。因此，非常有必要在不損害方法特異性的前提下，提高免疫分析方法的靈敏度。各種納米材料由于其獨特的物理化學特性，已被用于改善傳統免疫分析方法的分析性能。納米粒子具有較大比表面積，多樣的表面化學，被廣泛地應用于免疫分析中的富集和分離，以簡化預處理。納米顆粒的光學、電化學和磁特征也極大的增強了傳統免疫分析中的信號讀出與放大。在各種納米顆粒中，磁性納米顆粒(MNPs)引起了人們極大的興趣，因為MNPs不僅可以在磁場下很容易地分離，用在樣品預處理的載體，而且還可以用作磁信號傳感探針，因為MNPs可以導致一個不均勻的磁場，而不均勻的磁場會顯著縮短周圍水分子質子的橫向弛豫時間(T2)。此外，由于樣品基質中的磁信號可忽略不計，因此基于MNPs的磁弛豫時間免疫傳感器具有很高的信噪比，在食品安全和臨床診斷等領域得到了廣泛地應用。傳統的磁免疫傳感器的傳感機理主要分為兩個方面：(1)MNPs的狀態變化：MNPs偶聯上抗體之后，由于抗體-抗原之間的免疫識別作用，可以使原來分散的MNPs變成聚集狀態，進而會引起一個不均勻的磁場，導致T2信號發生改變，而傳統磁免疫傳感器的信號大都取決于MNPs的狀態變化，其靈敏度不足以檢測痕量的靶標，并且很容易受到非特異性聚集的干擾。(2)MNPs數量的變化：有研究表明磁信號T2對納米磁顆粒MNPs數量的變化更為敏感，因此，有研究者通過結合免疫磁分離，可以實現目標物和磁顆粒數量變化的一一對應，進而構建了基于納米磁顆粒數量變化的磁弛豫時間免疫傳感器，用于生物大分子，例如食源性致病菌、病毒等檢測。然而像農藥這類小分子化學物僅具有一個抗體結合位點，不能有效導致磁顆粒數量的改變，因此，需要借助其他放大手段才能將磁弛豫時間免疫傳感器用于痕量的農藥殘留小分子的高靈敏檢測。生物正交反應(Bioorthogonalreactions，BRs)具有反應速度快，特異性好等優勢，通過層層組裝的生物正交反應，可以極大增強MNPs結合在目標物上面的量，進而放大T2信號并增強傳統磁橫向弛豫時間免疫傳感器(T2-MRS)的靈敏度。因此，層層組裝的生物正交反應為克服T2-MRS檢測痕量小分子目標的靈敏度提供了一種有吸引力的工具。更為重要的是，一方面，我們通過生物正交反應，可以增加納米磁顆粒的偶聯量，進而引起納米磁顆粒數量的改變；同時，我們發現，通過生物正交反應，也可以使原來處于分散狀態的納米磁顆粒變成聚集狀態，即引起納米磁顆粒狀態的改變，從而進一步放大T2信號。因此，基于級聯生物正交反應，在MNPs數量的變化的基礎上，有機結合了MNPs的狀態變化，實現磁信號的級聯放大，進而構建了超靈敏的磁弛豫時間免疫傳感器，用于農藥小分子的快速檢測。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種基于生物正交反應檢測農藥殘留的生物傳感器方法，該方法可同時改變納米磁顆粒的聚集狀態和數量，二者有機結合進行磁信號級聯放大，從而提高農藥殘留檢測的準確性和靈敏度。一種基于納米磁顆粒數量和狀態變化的磁弛豫時間傳感器檢測農藥殘留的方法，包括以下步驟：1)將待測農藥與載體蛋白偶聯，然后再與羧基磁珠反應，得到偶聯有待測農藥完全抗原的磁珠；2)將識別待測農藥的單克隆抗體與二苯基環辛炔-四聚乙二醇-活性酯(DBCO-PEG4-NHSester)反應，得到二苯基環辛炔(DBCO)修飾的單克隆抗體；3)將偶聯有待測農藥完全抗原的磁珠和DBCO修飾的單克隆抗體加入到待測樣品溶液中，發生免疫競爭反應，磁分離后得到“磁珠-完全抗原-抗體-DBCO”免疫復合物；4)將15-疊氮基-4,7,10,13-四氧十五烷酸-N-琥珀酰亞胺基酯(Azide-PEG4-NHSester)與氨基納米磁顆粒反應，得到疊氮(Azide)標記的納米磁顆粒(azide-MNPs)，將產物磁分離后用PBS緩沖液重懸，然后加入到步驟3)得到的免疫復合物中，使Azide與DBCO發生生物正交反應，從而將納米磁顆粒偶聯到磁珠上，磁分離后收集上清液，上清液中含有未反應的azide-MNPs并且沒有反應的azide-MNPs數量和待測物的含量成正相關；5)向步驟4)磁分離后的上清液中加入疊氮化物交聯劑，觸發生物正交反應，形成納米磁顆粒-疊氮-疊氮化物交聯劑-疊氮-納米磁顆粒復合物，從而將原來分散狀態的納米磁顆粒改變為聚集狀態，使磁免疫傳感器的橫向弛豫時間信號被級聯放大，測量其橫向弛豫時間進而對農藥殘留定量分析。優選地，所述羧基磁珠的粒徑為500-3000nm。優選地，所述氨基納米磁顆粒的粒徑為10-100nm。優選地，所述疊氮化物交聯劑為二苯基環辛炔-四聚乙二醇-二苯基環辛炔(DBCO-PEG4-DBCO)。優選地，所述15-疊氮基-4,7,10,13-四氧十五烷酸-N-琥珀酰亞胺基酯與氨基納米磁顆粒的重量比為1：5。優選地，所述單克隆抗體與二苯基環辛炔-四聚乙二醇-活性酯反應的摩爾比為1：10。優選地，標記疊氮(Azide)的納米磁顆粒與DBCO-PEG4-DBCO生物正交反應的反應時間為20min。優選地，所述農藥為小分子化合物農藥，例如毒死蜱。優選地，所述農藥的載體蛋白為牛血清白蛋白。在本專利技術中，我們基于級聯生物正交反應(BRs)實現了磁納米顆粒(MNPs)數量和狀態的可控調節，并在此基礎上構建了一種超靈敏的磁弛豫時間免疫傳感器，用于農藥殘留的檢測。利用快本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種基于納米磁顆粒數量和狀態變化的磁弛豫時間傳感器對農藥殘留進行檢測的方法，其特征在于包括以下步驟：/n1)將待測農藥與載體蛋白偶聯，然后再與羧基磁珠反應，得到偶聯有待測農藥完全抗原的磁珠；/n2)將識別待測農藥的單克隆抗體與二苯基環辛炔-四聚乙二醇-活潑酯反應，得到二苯基環辛炔修飾的單克隆抗體；/n3)將偶聯待測農藥完全抗原的磁珠和二苯基環辛炔修飾的單克隆抗體加入到待測樣品溶液中，發生免疫競爭反應，磁分離后得到的“磁珠-完全抗原-抗體-二苯基環辛炔”的免疫復合物；/n4)將15-疊氮基-4,7,10,13-四氧十五烷酸-N-琥珀酰亞胺基酯與氨基納米磁顆粒反應，得到疊氮標記的納米磁顆粒，將產物磁分離后用PBS緩沖液重懸，然后加入到步驟3)得到的“磁珠-完全抗原-抗體-二苯基環辛炔”免疫復合物中，疊氮與二苯基環辛炔發生生物正交反應，從而疊氮標記的納米磁顆粒偶聯到磁珠上，磁分離后收集上清液，上清液中疊氮標記的納米磁顆粒數量發生改變；/n5)向步驟4)磁分離后的上清液中加入疊氮化物交聯劑，觸發生物正交反應，將原來分散狀態的疊氮-納米磁顆粒變為聚集狀態，使磁免疫傳感器的橫向弛豫時間信號被級聯放大，測量其橫向弛豫時間進而對農藥殘留定量分析。/n...

【技術特征摘要】
1.一種基于納米磁顆粒數量和狀態變化的磁弛豫時間傳感器對農藥殘留進行檢測的方法，其特征在于包括以下步驟：
1)將待測農藥與載體蛋白偶聯，然后再與羧基磁珠反應，得到偶聯有待測農藥完全抗原的磁珠；
2)將識別待測農藥的單克隆抗體與二苯基環辛炔-四聚乙二醇-活潑酯反應，得到二苯基環辛炔修飾的單克隆抗體；
3)將偶聯待測農藥完全抗原的磁珠和二苯基環辛炔修飾的單克隆抗體加入到待測樣品溶液中，發生免疫競爭反應，磁分離后得到的“磁珠-完全抗原-抗體-二苯基環辛炔”的免疫復合物；
4)將15-疊氮基-4,7,10,13-四氧十五烷酸-N-琥珀酰亞胺基酯與氨基納米磁顆粒反應，得到疊氮標記的納米磁顆粒，將產物磁分離后用PBS緩沖液重懸，然后加入到步驟3)得到的“磁珠-完全抗原-抗體-二苯基環辛炔”免疫復合物中，疊氮與二苯基環辛炔發生生物正交反應，從而疊氮標記的納米磁顆粒偶聯到磁珠上，磁分離后收集上清液，上清液中疊氮標記的納米磁顆粒數量發生改變；
5)向步驟4)磁分離后的上清液中加入疊氮化物交聯劑，觸發生物正交反應，將原來分散狀態的疊氮-納米磁顆粒變為聚集狀態，使磁免疫傳感器的橫向弛豫時間信號被級聯放大，測量其橫向弛豫時間進而對農藥殘留...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳翊平，董永貞，曾令文，
申請(專利權)人：武漢市農業科學院，華中農業大學，
類型：發明
國別省市：湖北;42