靶向Mesothelin的嵌合抗原受體并聯合表達抗PD1抗體的方法及其用途技術

本發明專利技術涉及靶向Mesothelin?aPD1的嵌合抗原受體及其用途。具體而言，本發明專利技術提供一種多核苷酸序列，選自：(1)含有依次連接的抗Meso單鏈抗體的編碼序列、人CD8α鉸鏈區的編碼序列、人CD8跨膜區的編碼序列、人41BB胞內區和抗人PD1單鏈抗體的編碼序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互補序列。本發明專利技術還提供相關的融合蛋白、含所述編碼序列的載體，以及所述融合蛋白、編碼序列、載體的用途。本發明專利技術制備的Mesothelin?aPD1?CAR?T細胞對特異性腫瘤細胞具強烈的殺傷功能，本發明專利技術制備的CAR?T細胞還能分泌抗PD1抗體具有調節免疫抑制微環境的作用。

Method and Application of Targeting Chimeric Antigen Receptor of Mesothelin and Jointly Expressing Anti-PD1 Antibody

The present invention relates to chimeric antigen receptors targeting Mesothelin_aPD1 and their applications. Specifically, the present invention provides a polynucleotide sequence selected from: (1) the coding sequence containing sequentially linked anti-Meso single chain antibodies, the coding sequence of human CD8alpha hinge region, the coding sequence of human CD8 transmembrane region, the coding sequence of human 41BB intracellular region and anti-human PD1 single chain antibody; and (2) (1) the complementary sequence of the polynucleotide sequence. The invention also provides the relevant fusion protein, the carrier containing the coding sequence, and the use of the fusion protein, the coding sequence and the carrier. The Mesothelin_aPD1 CAR_T cells prepared by the present invention have strong killing effect on specific tumor cells, and the CAR_T cells prepared by the present invention can secrete anti-PD1 antibodies, which can regulate the immunosuppressive microenvironment.

【技術實現步驟摘要】
靶向Mesothelin的嵌合抗原受體并聯合表達抗PD1抗體的方法及其用途
本專利技術屬于嵌合抗原受體領域，具體涉及靶向Mesothelin(SS1)-CD28-BBz-aPD1的嵌合抗原受體及其用途。
技術介紹
胰腺癌(PancreaticCarcinoma)是臨床上常見的消化系統惡性腫瘤，多見于50歲以上的人群。其發病率有明顯的地區差異，近年來發病率呈逐漸上升趨勢，在歐美國家已是第4位常見的惡性腫瘤，居消化道癌癥死因的第2位，僅次于大腸癌,其發病隱匿，早期癥狀無特異性，手術切除率低。在腫瘤發生發展的進程中，很多基因的活化及其產物的表達起到了重要的作用，其內在確切的分子機制尚不完全明確，隨著現代影像及內鏡技術的飛速發展，對一些癥狀體征及影像表現較為明顯的胰腺癌，明確診斷己沒有太大困難，但此時大多己失去最佳手術時機，而對于一些早期患者診斷較難。因此尋求新的治療手段，對于胰腺癌的治療是當務之急。在腫瘤的浸潤轉移過程的研究方面，間皮素(Mesothelin)也是當前研究的熱點。1996年Chang等利用宮頸癌HeLa細胞克隆出單克隆抗體識別的抗原，研究發現該抗原存在于正常間皮細胞，故命名為Mesothelin。腫瘤患者術后生存率低預后差的主要原因與它的浸潤轉移有關，腫瘤的浸潤轉移機制研究是目前的熱點和難點。Mesothelin基因編碼一種69kDa的前體蛋白，經加工形成一個40kDa的膜結合蛋白(即Mesothelin)和一個3lkDa稱之為巨核細胞促進因子MPF的脫落片斷。間皮素高表達于多種腫瘤組織中，卵巢癌患者血清中的MesothelinmRNA和蛋白質水平高表達，組織切片染色顯示非粘蛋白卵巢癌中有66％呈間皮素陽性；在胸膜間皮瘤的檢測中發現，15例確診為上皮性間皮瘤的病例全都呈陽性，4例肉瘤性間皮瘤全為陰性；Argani等研究報道，切除的原發性胰腺癌中，免疫組化法檢測表明60例有54例強陽性，而周圍正常胰腺組織則無Mesothelin反應活性；在其他實體腫瘤分析中，官頸、頭、頸、陰道、肺及食管的鱗癌冰凍切片中均可發現間皮素免疫活性，肺腺癌、子宮內膜癌、交界性滑膜肉瘤及結締組織增生性小圓細胞腫瘤有少量間皮素表達，在乳腺癌，甲狀腺癌、腎細胞癌、膀胱移細胞癌、黑色素癌及肝癌中僅有少許或沒有Mesothelin表達。Mesothelin的生物學功能尚未明確。Pastan等構建了一種Mesothelin基因突變小鼠，這些基因突變小鼠與同胞的野生型小鼠生長和繁殖相同，并且二者的血小板計數沒有統計學差異；有研究顯示Mesothelin與CA125結合能介導細胞粘附，由此研究者們也認為CA125和Mesothelin在卵巢癌的轉移擴散中可能起重要作用；另外，有研究亦表明，Mesothelin基因的表達受到Wnt等重要信號途徑的調節，如在卵巢癌和胰腺癌中，Wnt信號轉導途徑持續激活促使Mesothelin表達增加。雖然。Mesothelin的功能及其致癌作用仍有待于進一步明確，但其在正常組織中的分布有限而在某些腫瘤組織高度表達的特征，因而Mesothelin可作為腫瘤特異性抗體治療的靶向。嵌合抗原受體(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CAR-T)T細胞是指經基因修飾后，能以MHC非限制性方式識別特定目的抗原，并且持續活化擴增的T細胞。2012年國際細胞治療協會年會中指出生物免疫細胞治療已經成為手術、放療、化療外的第四種治療腫瘤的手段，并將成為未來腫瘤治療必選手段。嵌合抗原受體(CAR)是CAR-T的核心部件，賦予T細胞HLA非依賴的方式識別腫瘤抗原的能力，這使得經過CAR改造的T細胞相較于天然T細胞表面受體TCR能夠識別更廣泛的目標。CAR的基礎設計中包括一個腫瘤相關抗原(tumor-associatedantigen，TAA)結合區(通常來源于單克隆抗體抗原結合區域的scFV段)，一個胞外鉸鏈區，一個跨膜區和一個胞內信號區。目標抗原的選擇對于CAR的特異性、有效性以及基因改造T細胞自身的安全性來講都是關鍵的決定因素。目前在ClinicalTrials.gov注冊的抗MesothelinCAR-T細胞治療臨床試驗有10項，主要針對胰腺癌、卵巢癌、胸膜瘤、肺癌以及乳腺癌等惡性腫瘤。在賓夕法尼亞大學開展的I期臨床研究中，病人都是在接受過一線治療后病情進一步發展，并且腫瘤組織表達Mesothelin，他們接受了瞬轉CARmRNA的T細胞治療。這種Mesothelin特異性的二代CAR具有CD3ξ和4-1BB共刺激因子結構域。這些Mesothelin特異性的CART存活期短，在兩位病人中表現出了抗腫瘤作用，可見Mesothelin能夠作為CART細胞識別的抗原，并且瞬轉mRNA的方式也是可行的。另一項賓夕法尼亞大學開展的I期臨床研究使用的是慢病毒轉染的Mesothelin特異性CAR。這項開始于2014年7月的研究是針對耐化療的惡性胰腺癌、上皮性卵巢癌和惡性上皮胸膜間皮瘤。在6位病人的早期研究結果中，4位病人在CART細胞輸注28天后病情穩定。CART細胞輸注沒有引起急性副反應，并且相比mRNA瞬轉，慢病毒轉染構建的CART細胞的持續性得到提升。PD1(programmeddeath1)最初是在凋亡的T細胞雜交瘤中得到的，由于其和細胞凋亡相關而被命名為程序性死亡1受體。PD1受體表達于T細胞表面和初級B細胞表面，在這些細胞的分化和凋亡中發揮作用。PD1有兩個配體，分別是PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，屬于B7家族蛋白(Blood.2009.114(8):p.1537-44.)。PD-L1蛋白廣泛表達于抗原提呈細胞、活化T、B細胞、巨噬細胞、胎盤滋養層、心肌內皮和胸腺皮質上皮細胞。PD-L1與T細胞上的受體PD1相互作用，在免疫應答的負性調控方面發揮著重要作用。正常情況下，機體遇到外來病原體或抗原侵犯時，抗原提呈細胞捕獲抗原，對抗原進行加工使之成為T細胞可以識別的抗原表位，與MHC分子結合并呈現與細胞外側供T細胞識別。T細胞通過TCR與抗原提呈細胞的MHC分子結合，另外共刺激信號CD28受體與初始T細胞表面的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)結合，T細胞接到正向調控信號，初始T細胞活化為效應T細胞，啟動免疫應答。當有持續抗原刺激時，為避免應答過度，活化T細胞表面表達PD1，與抗原提呈細胞表面的PD-L1結合，向T細胞傳遞負向調控信號，T細胞增殖減少或凋亡。研究發現，在許多人類腫瘤組織中均可檢測到PD-L1蛋白的表達，腫瘤部位的微環境可誘導腫瘤細胞上PD-L1的表達，表達的PD-L1和T細胞表面的PD1結合抑制T細胞抗腫瘤活性，從而使腫瘤細胞逃避機體免疫系統的監視和清除，有利于腫瘤的發生和生長。PD1/PD-L1通路抑制劑可以阻斷PD1與PD-L1的結合，阻斷負向調控信號，使T細胞恢復活性，從而增強免疫應答。PD1/PDL1通路抑制劑主要包括anti-PD1或anti-PD-L1單抗。2014年7月，施貴寶的Opdivo率先在日本獲批用于治療晚期黑色素瘤，成為全球首個批準上市的PD1抑制劑。這是PD1抑制劑首次在III期臨床實驗中顯示生存期療效，其和化療藥達卡本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種氨基酸序列，所述氨基酸序列選自：(1)含有依次連接的抗Mesothelin單鏈抗體的編碼氨基酸序列、人CD8α鉸鏈區的編碼氨基酸序列、人CD8跨膜區的編碼氨基酸序列、人CD28胞內區的編碼氨基酸序列、人41BB胞內區的編碼氨基酸序列、人CD3ζ胞內區編碼氨基酸序列、和抗人PD1單鏈抗體的編碼氨基酸序列；和(2)(1)所述氨基酸序列。

【技術特征摘要】
1.一種氨基酸序列，所述氨基酸序列選自：(1)含有依次連接的抗Mesothelin單鏈抗體的編碼氨基酸序列、人CD8α鉸鏈區的編碼氨基酸序列、人CD8跨膜區的編碼氨基酸序列、人CD28胞內區的編碼氨基酸序列、人41BB胞內區的編碼氨基酸序列、人CD3ζ胞內區編碼氨基酸序列、和抗人PD1單鏈抗體的編碼氨基酸序列；和(2)(1)所述氨基酸序列。2.如權利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列在所述抗Mesothelin單鏈抗體的編碼序列前還含有信號肽的編碼序列，優選地，所述信號肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1第1-22位氨基酸所示；和/或所述抗Mesothelin單鏈抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQIDNO:1第23-128位氨基酸所示；和/或所述抗Mesothelin單鏈抗體的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQIDNO:1第141-259位氨基酸所示；和/或所述人CD8α鉸鏈區的氨基酸序列如SEQIDNO:1第260-306位氨基酸所示；和/或所述人CD8跨膜區的氨基酸序列如SEQIDNO:1第307-328位氨基酸所示；和/或所述人CD28胞內區的氨基酸序列如SEQIDNO:1第329-369位氨基酸所示；和/或所述人41BB胞內區的氨基酸序列如SEQIDNO:1第370-417位氨基酸所示；和/或所述人CD3ζ胞內區的氨基酸序列如SEQIDNO:1第418-528位氨基酸所示；和/或所述P2A氨基酸序列如SEQIDNO:1第529-554位氨基酸所示；和/或所述人IL-2信號肽氨基酸序列如SEQIDNO:1第555-574位氨基酸所示；和/或所述抗PD1單鏈抗體的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQIDNO:1第575-687位氨基酸所示；和/或所述抗PD1單鏈抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQIDNO:1第703-809位氨基酸所示。3.如權利要求2所述的多核苷酸序列，其特征在于，在所述抗Mesothelin單鏈抗體的編碼序列前的所述信號肽的編碼序列如SEQIDNO:2第1-66位核苷酸序列所示；和/或所述抗Mesothelin單鏈抗體的輕鏈可變區的編碼序列如SEQIDNO:2第67-384位核苷酸序列所示；和/或所述抗Mesothelin單鏈抗體的重鏈可變區的編碼序列如SEQIDNO:2第421-777位核苷酸序列所示；和/或所述人CD8α鉸鏈區的編碼序列如SEQIDNO:2第778-918位核苷酸序列所示；和/或所述人CD8跨膜區的編碼序列如SEQIDNO:2第919-984位核苷酸序列所示；和/或所述人CD28胞內區的編碼序列如SEQIDNO:2第985-1107位核苷酸序列所示；和/或所述人41BB胞內區的編碼序列如SEQIDNO:2第1108-1251位核苷酸序列所示；和/或所述人CD3ζ胞內區的編碼序列如SEQIDNO:2第1252-1584位核苷酸序列所示；和/或所述人P2A的編碼序列如SEQIDNO:2第1585-1662位核苷酸序列所示；和/或所述人IL-2信號肽的編碼序列如SEQIDNO:2第1663-1722位核苷酸序列所示；和/或所述抗PD1單鏈抗體的重鏈可變區的編碼序列如SEQIDNO:2第1723-2061位核苷酸序列所示；和/或所述抗PD1單鏈抗體的輕鏈可變區的編碼序列如...

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃飛，金濤，王海鷹，何鳳，史子嘯，
申請(專利權)人：上海恒潤達生生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海,31